能夠在體外自我復(fù)制的誘導(dǎo)性前癌干細(xì)胞或誘導(dǎo)性惡性干細(xì)胞，這些細(xì)胞的制備方法，及這些細(xì)胞的應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供可用于癌癥治療研究以及癌癥相關(guān)性創(chuàng)新藥物研究中的，在體外可自我復(fù)制的誘導(dǎo)性癌癥干細(xì)胞、這些的制備方法、由這些細(xì)胞誘導(dǎo)的癌細(xì)胞、以及這些細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供能夠在體外自我復(fù)制的誘導(dǎo)性癌癥干細(xì)胞，其特征在于：至少具有下述（1）和（2）的要素：（1）表達(dá)POU5F1基因、NANOG基因、SOX2基因、ZFP42基因、LIN28基因和TERT基因這6種基因；（2）具有（a）內(nèi)源性抑癌基因突變，或（b）內(nèi)源性癌癥相關(guān)基因的表達(dá)升高中任一種的異常。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及誘導(dǎo)性前癌干細(xì)胞或誘導(dǎo)性惡性干細(xì)胞，涉及具有內(nèi)源性抑癌基因突變、內(nèi)源性癌相關(guān)基因表達(dá)升高等的異常，表達(dá)P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因、LIN28基因、TERT基因等的自我復(fù)制相關(guān)基因，能夠在體外進(jìn)行自我復(fù)制的誘導(dǎo)性前癌干細(xì)胞或誘導(dǎo)性惡性干細(xì)胞(本專(zhuān)利技術(shù)在下文中統(tǒng)稱(chēng)為“誘導(dǎo)性癌癥干細(xì)胞”)，這些細(xì)胞的制備方法，以及這些細(xì)胞的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
近年來(lái)，通過(guò)研究胚胎干細(xì)胞(也稱(chēng)為“ES細(xì)胞”。在本說(shuō)明書(shū)下文中記載為“胚胎干細(xì)胞”)，和通過(guò)進(jìn)一步研究體細(xì)胞克隆胚胎干細(xì)胞，以及體細(xì)胞克隆動(dòng)物的創(chuàng)造等所謂的體細(xì)胞克隆，認(rèn)為可以對(duì)表觀遺傳學(xué)(DNA甲基化和組蛋白修飾)進(jìn)行重新編程(也稱(chēng) 為“初始化”。在本說(shuō)明書(shū)下文中記載為“重新編程”)。實(shí)際上，有人報(bào)道了這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果將作為癌細(xì)胞的小鼠黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵細(xì)胞中，所述卵細(xì)胞開(kāi)始胚胎發(fā)生，從所述胚胎獲得的胚胎干細(xì)胞可分化為黑色素細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的細(xì)胞(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。最近，報(bào)告了通過(guò)導(dǎo)入0CT3/4基因(也有時(shí)記載為“ 0CT3基因”、“ 0CT4基因”或“P0U5F1基因”的情況)、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，或者在存在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF或FGF2)的情況下，導(dǎo)入0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2),可以從人的體細(xì)胞重新編程制備誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced PluripotentStemCells;也稱(chēng)為“iPS細(xì)胞”)，S卩，與胚胎干細(xì)胞一樣未分化的細(xì)胞(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。已知人的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞具有2個(gè)特點(diǎn)(I)具有向三胚層分化的分化多能性，所述三胚層是能夠形成建成個(gè)體形態(tài)的所有細(xì)胞；(2)具有在人胚胎干細(xì)胞能夠自我復(fù)制的培養(yǎng)條件下，可以維持其未分化性的情況下在培養(yǎng)皿中無(wú)限傳代培養(yǎng)，即所謂的自我復(fù)制能力。因此，這類(lèi)人的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞表面抗原、長(zhǎng)期的自我復(fù)制能力、形成畸胎瘤(在體內(nèi)分化為三胚層)的能力的方面，與人胚胎干細(xì)胞非常相似(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3、非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)，此外，還報(bào)道了 HLA基因型與來(lái)源細(xì)胞的體細(xì)胞完全相同(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。這些細(xì)胞的制備方法是只導(dǎo)入上述基因(即，0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因，或在存在bFGF的情況下的0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因)，即可使已分化的體細(xì)胞“重新編程”為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞。一方面，基于基因突變和/或表觀遺傳學(xué)的異常，產(chǎn)生基因表達(dá)的升高、降低或消失的異常，由此使細(xì)胞癌變。因此，使用上述重新編程的技術(shù)，可以將癌細(xì)胞中發(fā)生的各種異常重新編程，使其恢復(fù)為正常的細(xì)胞，喪失癌細(xì)胞的性質(zhì)。實(shí)際上，最近在國(guó)際干細(xì)胞學(xué)會(huì)(ISSCR)中，有人發(fā)表了以下發(fā)現(xiàn)“向培養(yǎng)皿中的人肝癌細(xì)胞株來(lái)源的癌癥干細(xì)胞(HuH7來(lái)源的CD133陽(yáng)性細(xì)胞)中添加抗癌劑等2種化學(xué)物質(zhì)(非環(huán)型視黃醒(acyclic retinoids)和托瑞司他(tolrestat)), 2天后,85-90%的癌細(xì)胞變成了正常的肝細(xì)胞。進(jìn)一步的，添加2個(gè)基因(S0X2基因和KLF4基因)與2種化學(xué)物質(zhì)(5-AZAC和TSA)，則成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，按照向肝細(xì)胞分化的規(guī)程(protocol)，成功地使所獲得的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞(AFP或ALB陽(yáng)性細(xì)胞)”(非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。此外，使作為癌細(xì)胞的小鼠黑色素瘤細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的論文(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)報(bào)道了通過(guò)導(dǎo)入0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因而重新編程的結(jié)果，使從作為成癌原因的具有BCR-ABL酪氨酸激酶活性的慢性骨髓性白血病細(xì)胞(CML)制備出喪失了 BCR-ABL酪氨酸激酶依賴(lài)性的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。此外，還報(bào)道了向癌細(xì)胞株中導(dǎo)入0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因，通過(guò)重新編程消除了抗藥性和成瘤能力，但是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)，伴隨c-MYC基因的活化而產(chǎn)生癌變(非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。在傳統(tǒng)研究中，通過(guò)強(qiáng)制表達(dá)SV40、HPV的E6基因、E7基因、TERT基因進(jìn)行細(xì)胞的永生化培養(yǎng)，通過(guò)導(dǎo)入c-MYC基因、RAS基因等癌基因引起癌變等，在建立癌細(xì)胞株后，再用于用普通的常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的癌細(xì)胞株。然而，在用普通的常規(guī)培養(yǎng)基建立的癌細(xì)胞株中，存在這樣的問(wèn)題S卩，由于顯著·地產(chǎn)生培養(yǎng)后的人為的染色體異常(轉(zhuǎn)座、缺失等)、遺傳學(xué)異常(基因突變)、成為基因表達(dá)異常的原因的表觀遺傳學(xué)異常，難以原樣保持在原本作為生物體內(nèi)成癌原因的原癌細(xì)胞、癌細(xì)胞中發(fā)生的異常。這些細(xì)胞株均不是通過(guò)在體外的自我復(fù)制的培養(yǎng)中建立的細(xì)胞株。在癌癥治療的研究和癌癥相關(guān)的制藥研究中，即使分析這類(lèi)用傳統(tǒng)培養(yǎng)基建立的癌細(xì)胞株的遺傳學(xué)異常和表觀遺傳學(xué)異常，也極其難以判斷這些異常是在哺乳動(dòng)物的原有的原癌細(xì)胞、癌細(xì)胞中發(fā)生的異常，還是在培養(yǎng)后發(fā)生的人為異常，因此基于這些分析結(jié)果不能進(jìn)行正確的癌癥成因探索、創(chuàng)新藥物靶的探索、癌癥治療藥物的篩選等。此外，雖然作為創(chuàng)新藥物靶的癌癥干細(xì)胞的存在受到重視，但是存在這樣的問(wèn)題，即包含在新鮮的癌組織中的癌細(xì)胞是分階層的(hierarchical)、異質(zhì)的細(xì)胞群，無(wú)法弄清楚哪些癌細(xì)胞是癌癥干細(xì)胞。近年來(lái)，報(bào)道了從癌細(xì)胞株或原代培養(yǎng)癌細(xì)胞中鑒別出癌癥干細(xì)胞的研究(非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)。但是，尚未有將單克隆癌癥干細(xì)胞在體外自我復(fù)制而進(jìn)行了長(zhǎng)期培養(yǎng)的報(bào)告，也未有將其通過(guò)自我復(fù)制增殖培養(yǎng)，而獲得使其足以在體外應(yīng)用于創(chuàng)新藥物、或癌癥研究所必需的數(shù)量的報(bào)導(dǎo)。(現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn))(專(zhuān)利文獻(xiàn))專(zhuān)利文獻(xiàn)I :日本特開(kāi)2008-283972專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2008-307007(非專(zhuān)利文獻(xiàn))非專(zhuān)利文獻(xiàn)I :Hochedlinger K, Jaenisch R 等人，Genes Dev. , 2004, 18 1875-1885非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Nakagawa M, Yamanaka S等人,Nat Biotechnol. , 2008, 26 :101-106非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :Takahashi K, Yamanaka S 等人，Cell, 2007，131 :861-872非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 Masaki H, Ishikawa T 等人，Stem Cell Res. , 2008, I :105-115非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :國(guó)際干細(xì)胞學(xué)會(huì)、2009年、抄錄序號(hào)1739 (285頁(yè))非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :Utikal J 等人，J Cell Sci.，2009，122 (Ptl9) :3502-3510非專(zhuān)利文獻(xiàn)7 =Carette JE 等人，Blood, 2010，115 :4039-4042非專(zhuān)利文獻(xiàn)8 :Nagai K 等人,Biochem Biophys Res Commun.，2010，395 :258-263非專(zhuān)利文獻(xiàn)9 :Visvader JE, Lindeman GJ, Nat Rev Cancer. , 2008, 8 :755-768
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
(專(zhuān)利技術(shù)要解決的問(wèn)題)因此，本專(zhuān)利技術(shù)的目的，是提供具有與成癌相關(guān)的特定基因突變或基因表達(dá)異常、能夠在體外自我復(fù)制的誘導(dǎo)性癌癥干細(xì)胞，以及所述誘導(dǎo)性癌癥干細(xì)胞本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：石川哲也，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：獨(dú)立行政法人國(guó)立癌癥研究中心，
類(lèi)型：
國(guó)別省市：