穩(wěn)定共表達(dá)hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK細(xì)胞系及構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，具體涉及將編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和將編碼β1-4GalT1基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，最終獲得能穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β1-4GalT1基因的MDCK細(xì)胞系MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1，該細(xì)胞系可用于禽流感病毒疫苗株的大規(guī)模細(xì)胞化培養(yǎng)和生產(chǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及工程細(xì) 胞系MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl及其構(gòu)建方法，所構(gòu)建細(xì)胞系可用于禽流感疫苗株的大規(guī)模細(xì)胞化生產(chǎn)。
技術(shù)介紹
流感病毒表面的血凝素(HA)通過與宿主細(xì)胞表面的唾液酸寡糖受體結(jié)合從而起始病毒感染宿主細(xì)胞，禽源和馬源流感病毒偏嗜結(jié)合α 2，3-唾液酸寡糖受體(Neu5Aca2，3Gal)，而人源和豬源流感病毒偏嗜結(jié)合α2，6_唾液酸寡糖受體(Neu5Ac α 2，6Gal)。因此，細(xì)胞表面唾液酸受體的類型及豐度，影響流感病毒對(duì)不同宿主的適應(yīng)性。不同的唾液酸受體對(duì)流感病毒在宿主細(xì)胞中感染、復(fù)制和擴(kuò)散產(chǎn)生重要的影響。目前獲得批準(zhǔn)生產(chǎn)的是雞胚來源的滅活疫苗。哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出較好的保護(hù)性作用，當(dāng)前Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞系(MDCK)被認(rèn)為是培養(yǎng)A型和B型流感病毒最適合的細(xì)胞系。傳統(tǒng)的流感病毒疫苗是依靠雞胚生產(chǎn)的，病毒經(jīng)過培養(yǎng)增殖、濃縮、滅活、進(jìn)一歩純化，配制、無菌灌裝，最后檢測和放行。除了研發(fā)使用高產(chǎn)重組毒株作為A型流感的種毒，基本生產(chǎn)エ藝在過去的60年幾乎沒什么變化。不僅成本代價(jià)高，而且雞胚的殘留物質(zhì)還可能引起過敏反應(yīng)，此外，當(dāng)面臨高致病流感病毒導(dǎo)致的全球大流行時(shí)，傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)方法可能不足以滿足全球疫苗市場的需求。因此，研究機(jī)構(gòu)和疫苗公司正在合作開發(fā)新的生產(chǎn)技木，以達(dá)到省時(shí)高效的目的。為了獲得流感疫苗生產(chǎn)的替代方法，疫苗公司已經(jīng)嘗試了許多新的途徑。組織培養(yǎng)的細(xì)胞系作為雞胚生產(chǎn)方式的一種補(bǔ)充或替代方法，已經(jīng)引起了人們的重視。細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)主要具有以下優(yōu)勢1)可以應(yīng)用許多在雞胚生產(chǎn)系統(tǒng)中得到臨床驗(yàn)證的基本方法(如全病毒的生產(chǎn)、多步裂解、純度更高的流感抗原或減毒活疫苗)，同時(shí)，縮短雞胚生產(chǎn)的供應(yīng)時(shí)間，穩(wěn)定產(chǎn)品供應(yīng)鏈；2)可以應(yīng)用更加先進(jìn)可控的種毒生產(chǎn)系統(tǒng)，由于生產(chǎn)用細(xì)胞特征的高度一致性，降低了引入外源性污染的風(fēng)險(xiǎn)；3)提供了一種更加高效、穩(wěn)定、可重復(fù)的疫苗生產(chǎn)方式，使用一種規(guī)格可變且封閉的生物反應(yīng)器，可以在任意時(shí)間起始反應(yīng)，并可以根據(jù)需要延長生產(chǎn)周期；4)提高了部分禽流感毒株生產(chǎn)疫苗的能力。除了上述優(yōu)點(diǎn)，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗至少具有一種理論上的優(yōu)點(diǎn)在雞胚中進(jìn)行的流感病毒的分離和復(fù)制通常會(huì)產(chǎn)生特定表型的選擇，而這種選擇往往不同于正確的人類分離株。相反，在細(xì)胞中進(jìn)行的流感病毒的分離復(fù)制不會(huì)產(chǎn)生這種傳代依賴性的表型選擇。從而有利于表達(dá)天然構(gòu)象的血凝素抗原，優(yōu)化抗體的特異性。Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞系(MDCK)來源于ー只成年獵犬的腎臟組織。關(guān)于MDCK細(xì)胞來源的季節(jié)性流感疫苗的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，MDCK細(xì)胞來源的病毒經(jīng)過連續(xù)傳代之后，可以保持抗原的穩(wěn)定性，此類疫苗的安全性和免疫原性與雞胚來源的疫苗相當(dāng)。人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV (hST3GalIV)能將唾液酸(Neu5Ac)轉(zhuǎn)移到糖蛋白的末端的2型糖鏈(Gal β l-4GlcNAc)，或者I型糖鏈(Gal β l_3GlcNAc)上的半乳糖(Gal)，Neu5Ac和末端的Gal之間連鍵是α 2-3。hST3GalIV優(yōu)先作用于2型糖鏈(Gal β l_4GlcNAc)，其次才是 I 型糖鏈(Gal β l_3GlcNAc)。人源β 1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I (UDP-半乳糖Ν-こ酰氨基葡萄糖基β 1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱為β l_4GalTl，EC2.4. I. 38)，是ー組II型膜結(jié)合糖蛋白，能把半乳糖基(Gal)轉(zhuǎn)移到糖鏈的N-こ酰葡萄糖(GlcNAc)上，Gal與GIcNAc之間的連鍵是β 1-4。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本研究首次建立了提高禽流感病毒α 2，3-唾液酸豐度的MDCK細(xì)胞系一MDCK-hST3GalIV-P4GalTl 細(xì)胞。通過穩(wěn)定共表達(dá) hST3GalIV 和 β l_4GalTl，可以增強(qiáng)β l-4GalTl催化半乳糖與N-こ酰葡萄糖以β 1-4連鍵連接的效力，hST3GalIV催化唾液酸與半乳糖以α 2-3連鍵連接的效力，從而提高M(jìn)DCK細(xì)胞表面α2，3_唾液酸豐度。該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系細(xì)胞表面α 2，3-唾液酸顯著高于母本MDCK細(xì)胞系，與母本MDCK細(xì)胞系相比，禽流感病毒的分離株和疫苗候選株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系上形成更大的 噬斑，生長滴度更高。穩(wěn)定共表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK細(xì)胞系建立之后，更適合禽流感病毒的生長，無論是病毒滴度還是噬斑形成能力都要更高，也證明了禽流感病毒對(duì)α 2，3-唾液酸的偏嗜性，不僅為研究α 2，3-唾液酸受體提供了方便的工具，對(duì)于實(shí)時(shí)監(jiān)測禽流感病毒進(jìn)行受體結(jié)合特性、檢測禽流感病毒變異株的出現(xiàn)、發(fā)現(xiàn)受體結(jié)合特性發(fā)生變化的禽流感毒株具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。此外，MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系在抗禽流感病毒藥物、疫苗株篩選以及細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的生產(chǎn)方面都展示出較好的應(yīng)用前景。本專利技術(shù)穩(wěn)定表達(dá)人源β -半乳糖苷α 2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV(hST3GalIV)和β 1-4半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β l-4GalTl)的MDCK細(xì)胞系，是MDCK-hST3GalIV-0 4GalTl ;保藏號(hào)為CGMCC No. 5967。所述的 MDCK_hST3GalIV_ β 4GalTl 細(xì)胞系同時(shí)含有編碼 hST3GalIV 的基因和編碼β l_4GalTl的基因。所述編碼hST3GalIV的基因序列如SEQ ID No:l所顯示，其所編碼的hST3GalIV的氨基酸序列如SEQ ID No:3所顯示；所述編碼β l_4GalTl的基因序列如SEQ ID No:2所顯示，其所編碼的β l_4GalTl的氨基酸序列如SEQ ID No:4所顯示。所述編碼hST3GalIV基因序列和β l_4GalTl基因序列來自于人。本專利技術(shù)的另ー個(gè)方面，提供構(gòu)建MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系的方法，所述方法包括將hST3GalIV和β l_4GalTl的基因重組到MDCK細(xì)胞的基因組中。所述MDCK-hST3Gal IV-MGalTl細(xì)胞系的構(gòu)建方法，是將帶有編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和帶有編碼β l_4GalTl基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，最終獲得能穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl基因的細(xì)胞系MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl。在本專利技術(shù)的另ー個(gè)方面中，提供ー種提高禽流感病毒生長滴度的方法，該方法包括，將H5N1亞型或H9N2亞型禽流感病毒株接種于本專利技術(shù)構(gòu)建的MDCK-hST3GalIV-^4GalTl細(xì)胞系中，病毒在所述細(xì)胞系上的培養(yǎng)條件為35°C、5%C02。毒株在MDCK-hST3GalIV-i3 4GalTl細(xì)胞系中生長滴度的提高，為禽流感疫苗的細(xì)胞化生產(chǎn)提供了有利條件。更具體地說，在本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼hST3GalIV基因的真核表達(dá)載體和β l_4GalTl基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到MDCK細(xì)胞系中，構(gòu)建穩(wěn)定共表達(dá)hST3GalIV和 β l-4GalTl 的MDCK細(xì)胞系，本專利技術(shù)中一株表達(dá)hST3GalIV和 β l_4GalTl 的Madin-Darby犬腎細(xì)胞系MDC本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β1？4GalT1的MDCK細(xì)胞系，是MDCK？hST3GalIV？β4GalT1，其含有hST3GalIV和β1？4GalT1基因序列；所述hST3GalIV的基因序列如SEQ？ID？No:？1所示，所述β1？4GalT1的基因序列如SEQ？ID？No:？3所示；所述細(xì)胞系的保藏號(hào)是CGMCC？No.？5967。

【技術(shù)特征摘要】
2012.07.12 CN 201210240483.31.一種穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl的MDCK細(xì)胞系，是MDCK-hST3GalIV-P 4GalTl，其含有 hST3GalIV 和 β l_4GalTl 基因序列；所述hST3GalIV 的基因序列如SEQ ID No: I所示,所述β l-4GalTl的基因序列如SEQ ID No: 3所示；所述細(xì)胞系的保藏號(hào)是CGMCC No. 5967。2.權(quán)利要求I所述的穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和βl_4GalTl的MDCK細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，是將帶有編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和帶有編碼β l_4GalTl基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，最終獲得能穩(wěn)定表達(dá)hST3GalIV和β l_4GalTl基因的細(xì)胞系 MDCK-hST3GalIV- β 4GalTl。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述MDCK-hST3GalIV-04GalTl細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下具體步驟 1)MDCK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及抗性細(xì)胞克隆的篩選 轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞密度在6孔板至80% 90%密度時(shí)用于轉(zhuǎn)染；將編碼hST3GalIV基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒和編碼β l-4GalTl基因序列的真核表達(dá)質(zhì)粒各I μ g質(zhì)粒于100 μ L無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻后添加5 μ L FuGENEeHD轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻之后室溫孵育15分；將上述復(fù)合物覆蓋于細(xì)胞表面，補(bǔ)加無血清Opti-MEM培養(yǎng)基至總體積為2 mL，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后移除培養(yǎng)物，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； 抗性細(xì)胞克隆的篩選轉(zhuǎn)染后36小時(shí)后用胰酶消化細(xì)胞，按1:10的比例傳代至48孔細(xì)胞板中，繼續(xù)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉秀梵，孫慶，張文俊，王曉泉，胡順林，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：揚(yáng)州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：