本發(fā)明專利技術(shù)為在安全性試驗，毒性試驗，代謝試驗，藥物相互作用試驗，抗病毒活性試驗,高脂血癥藥、高血壓治療藥、低分子化合物藥物、抗體藥物等藥物的篩選試驗，新藥發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)篩選，動物模型制作，肝臟合成蛋白的生產(chǎn)及再生醫(yī)療中有用的下述誘導(dǎo)肝干細(xì)胞、其制造方法及該細(xì)胞的用途。一種誘導(dǎo)肝干細(xì)胞，其特征在于，至少具備下述（1）～（3）的特征，（1）表達(dá)選自作為胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因的特定基因群中的至少15種基因，（2）具有肝細(xì)胞的性質(zhì)，（3）能夠增殖培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)3天以上。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及在安全性試驗，毒性試驗，代謝試驗，藥物相互作用試驗，抗病毒活性試驗，高脂血癥藥、 高血壓治療藥、低分子化合物藥物、抗體藥物等藥物的篩選試驗，新藥發(fā)現(xiàn)革巴標(biāo)篩選，動物模型制作，肝臟合成蛋白(hepatocyte-produced proteins)的生產(chǎn)及再生醫(yī)療中有用的誘導(dǎo)肝干細(xì)胞，特別涉及特征在于具有肝細(xì)胞的性質(zhì)、以與胚胎干細(xì)胞同等的量表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因群且能夠長期增殖繼代培養(yǎng)的誘導(dǎo)肝干細(xì)胞、其制造方法及該細(xì)胞的用途。
技術(shù)介紹
制藥企業(yè)的新藥研究開發(fā)均存在研究開發(fā)周期長且研究開發(fā)費用高的問題。并且，現(xiàn)狀是雖然存在多個預(yù)期將來將成為新藥的候補，但隨著研究開發(fā)的進(jìn)展而產(chǎn)生有效性、安全性的問題，其中的大半不得不放棄開發(fā)。通常，開發(fā)新藥需要長達(dá)9 17年的較長時間和數(shù)十億元 數(shù)百億元的巨額研究開發(fā)費用，因此可以說，若存在能夠在臨床前等早期階段縮小候補化合物范圍的新藥發(fā)現(xiàn)工具，則能夠減少其開發(fā)費用。然而，在目前的非臨床試驗中，在藥物的安全性、毒性等的評價中，必須使用動物進(jìn)行試驗，這也是開發(fā)費居高不下的原因之一。此外，由于人和動物的種間差異，有時藥物在生物體內(nèi)的動態(tài)是不同的，因而有時無法對安全性進(jìn)行充分評價，進(jìn)入臨床試驗階段才獲知候補化合物具有毒性而放棄開發(fā)。因此，非常希望建立在研究開發(fā)的早期階段對候補化合物在人活體內(nèi)的動態(tài)等進(jìn)行預(yù)測及評價的評價體系，目前已經(jīng)開展了以構(gòu)建使用人肝細(xì)胞的評價系統(tǒng)來代替具有“種間差異壁壘”的界線的動物實驗為目標(biāo)的研究。這樣的評價系統(tǒng)由于能夠在藥物開發(fā)的早期階段準(zhǔn)確地篩出安全性高的候補藥，因此在制藥企業(yè)中存在較大需求。目前的使用人培養(yǎng)細(xì)胞的非臨床試驗中，使用的是外國人的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞或已有細(xì)胞株等。然而，原代培養(yǎng)肝細(xì)胞存在供體稀缺、批次差異非常大的問題。尤其是，日本人的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞由于倫理問題及法律限制而非常難獲得，無法實現(xiàn)穩(wěn)定供給。進(jìn)而，肝臟中表達(dá)的藥物代謝酶發(fā)揮著催化多種藥物代謝的重要作用，但存在基因多態(tài)性且其表達(dá)量及活性也存在較大個體差異，因此使得上述非臨床試驗中的問題更加嚴(yán)峻。此外，為了應(yīng)對數(shù)量龐大的個體的差異，希望能夠以囊括這些差異的來自多個供體的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞作為代表細(xì)胞而重復(fù)用于各種試驗。然而，即使在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞，也幾乎無法進(jìn)行增殖培養(yǎng)，因此還存在實際中無法對該肝細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)并反復(fù)用于各種試驗的問題。另一方面，現(xiàn)有細(xì)胞株大多是發(fā)生了核型異常的細(xì)胞，此外，也不存在囊括數(shù)量龐大的個體的差異的多個細(xì)胞株。進(jìn)而，通過現(xiàn)有方法長期繼代培養(yǎng)的現(xiàn)有細(xì)胞株由于未顯示出與原代培養(yǎng)肝細(xì)胞同樣的藥物代謝酶活性、轉(zhuǎn)運蛋白誘導(dǎo)能力，因此無法由其結(jié)果預(yù)測臨床中對人的安全性、代謝等。由上述諸多情況可知，雖然期待具有肝細(xì)胞的性質(zhì)、能夠長期繼代培養(yǎng)的細(xì)胞，但尚未報道從囊括數(shù)量龐大的個體的差異的多個供體發(fā)現(xiàn)這樣的細(xì)胞。此外，設(shè)想存在肝臟的干細(xì)胞、即具有分化為肝細(xì)胞能力的肝干細(xì)胞。然而，還不存在發(fā)現(xiàn)如胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞那樣表達(dá)自我復(fù)制基因、具有能夠長期在生物體外繼代培養(yǎng)的性質(zhì)的肝干細(xì)胞的報道。因此，在生物體外，理論上能夠分化為所有組織的體細(xì)胞、生殖細(xì)胞的保持分化多能性且能夠以未分化的狀態(tài)幾乎無限地自我復(fù)制的胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ES細(xì)胞)(本說明書中以下記為“胚胎干細(xì)胞”。)是否不僅能夠用于再生醫(yī)療而且可以用于 新藥發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域還在研究之中。胚胎干細(xì)胞是指由屬于動物的發(fā)生初期階段的囊胚期的胚的一部分的內(nèi)部細(xì)胞塊制備的干細(xì)胞株，取英語的頭一個字母時也被稱為ES細(xì)胞。為了建立胚胎干細(xì)胞，需要受精卵或由受精卵進(jìn)一步發(fā)生至囊胚階段的初期胚。在人的情況下，由于使用受精卵作為材料，認(rèn)為存在使生命的萌芽消滅這一倫理問題。因此，存在著不允許制作和研究人胚胎干細(xì)胞的國家，此外，即使在認(rèn)為具有治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病、脊髓損傷等目前無法根治的疾病的可能性而允許對其進(jìn)行研究的國家，對人胚胎干細(xì)胞的操作也加以嚴(yán)格的限制。因此，胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究中倫理問題是一個較大的障礙。此外，實際中為了使用胚胎干細(xì)胞，需要使胚胎干細(xì)胞分化為某種特定細(xì)胞，積極地開發(fā)了分化為肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞等的方法。然而，這樣分化為特定細(xì)胞較為困難，特別是難以誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞。目前尚未建立高效分化誘導(dǎo)為能夠用于新藥發(fā)現(xiàn)研究的高品質(zhì)成熟肝干細(xì)胞的方法。目前報告的所有分化誘導(dǎo)法均需要3周左右的較長時間，花費了較高費用、勞力、時間而高度分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞樣細(xì)胞幾乎無法增殖。最近報道了 通過導(dǎo)入0CT3/4基因(0CT3/4為基因名，有時也記作0CT3或4，在本說明書中以下記作POUFI基因。)、S0X2基因、KLF4基因及c_MYC基因(專利文獻(xiàn)I)或在堿性成纖維細(xì)胞生長因子存在下導(dǎo)入P0U5F1基因、S0X2基因及KLF4基因(非專利文獻(xiàn)I )，從而能夠由人等的體細(xì)胞制作稱為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的與胚胎干細(xì)胞同樣的未分化細(xì)胞(專利文獻(xiàn)2)。已知的是，人的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem Cells;iPS細(xì)胞)(本說明書中，以下記為“誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞”。)具有如下兩個特征(1)分化多能性能夠分化為形成個體的所有細(xì)胞的三胚層，(2)自我復(fù)制能力在特定的條件下，能夠維持其未分化性狀態(tài)地在培養(yǎng)皿中無限地繼代培養(yǎng)。并且，該人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞在形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞表面抗原、長期自我復(fù)制能力、畸胎瘤(良性腫瘤)形成能力方面與人胚胎干細(xì)胞非常類似(非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3)，進(jìn)而，報道指出HLA的基因型與其來源細(xì)胞即體細(xì)胞完全相同(非專利文獻(xiàn)3)。通常認(rèn)為，在該誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的制作中，僅僅向細(xì)胞中導(dǎo)入P0U5F1基因、S0X2基因、KLF4基因、c-MYC基因這4個基因或P0U5F1基因、S0X2基因、KLF4基因這3個基因，即可使已經(jīng)分化的體細(xì)胞“初始化·復(fù)位”成未分化的多能性干細(xì)胞。然而，人細(xì)胞的情況下，用4個基因時僅能以O(shè). 1%-0. 01 %、用3個基因時僅能以O(shè). 01%-0. 001%的效率由體細(xì)胞制作誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。因此，99. 9%-99. 999%的細(xì)胞無法通過基因?qū)攵鴱?fù)位為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞。進(jìn)而，在胚胎干細(xì)胞中特異性表達(dá)的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因等為對維持多能性干細(xì)胞的未分化性而言很重要的因子，可以認(rèn)為其抑制了細(xì)胞的分化。因此，在已分化的細(xì)胞中，隨著分化基因(分化細(xì)胞的性質(zhì))的表達(dá)，作為對維持未分化性而言很重要的因子的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因的表達(dá)則消失。也即，通常認(rèn)為，使對維持未分化性而言很重要的因子NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因以及分化細(xì)胞的多種性質(zhì)(多個分化基因的表達(dá))一起進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞是無法制作的。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn) 專利文獻(xiàn)I :日本特開2008-283972 專利文獻(xiàn)2 日本特開2008-307007非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Nakagaw本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：石川哲也，萩原啟太郎，落谷孝廣，
申請(專利權(quán))人：日本國立癌癥研究中心，
類型：
國別省市：
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