一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法技術

本發明專利技術公開了一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法，包括以下步驟：將獲得單細胞狀態的人肝癌細胞，加入培養基中，制成細胞懸液；將細胞懸液滴加到多孔纖維素支架上，待細胞懸液滲入到多孔纖維素支架內部，置于細胞培養箱中培養貼附，然后再加入培養基置于細胞培養箱中培養數日，得到三維培養細胞；通過使用Western?Blot、定量PCR、流式細胞術和IHC檢測三維培養細胞中的肝癌干細胞標志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表達情況的變化和（或）顯微鏡觀察，檢測轉化的肝癌干細胞。本發明專利技術還公開了肝癌干細胞及其應用。本發明專利技術獲得的肝癌干細胞具有耐藥性。

Method for inducing liver cancer cell to transform into liver cancer stem cell

The invention discloses a method for inducing the cells to liver cancer stem cells, which comprises the following steps: obtaining human hepatocellular carcinoma cells with single cell state, into the culture medium into cell suspension; the cell suspension was dripped into the porous cellulose scaffold, the cell suspension was infiltrated into the internal porous cellulose scaffold. In the attached cells were cultured in the box, and then added to the medium in culturing days box, three-dimensional cell culture; through the use of 3D cell culture Western detection Blot, quantitative PCR, flow cytometry and IHC in liver cancer stem EpCAM, OCT4, CD44 expression and CD133 and the change of cell mark (or) microscope, detection of transformed liver cancer stem cells. The invention also discloses a liver cancer stem cell and the application thereof. The liver cancer stem cell obtained by the invention has drug resistance.

【技術實現步驟摘要】
一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法
本專利技術屬于腫瘤學和干細胞學研究領域，具體涉及一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法。
技術介紹
肝癌是一種終末期肝病，病情兇險，病死率高達80％，是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。我國是肝病高發國家，目前有各類肝病患者1億余人，全球每年新發100例肝癌中，有55例是中國人。有研究認為腫瘤干細胞的存在是惡性腫瘤發生的重要原因。肝癌干細胞能夠抵抗癌癥治療藥物，抵御化療輻射，增加術后的腫瘤復發和轉移幾率。綜上，如何開發出合適的細胞培養和篩選方法以有效分離篩選出肝癌干細胞，從而用以肝癌發病機制，藥物及免疫治療等方面的研究是本專利技術所要解決的主要問題。既往的研究表明，EpCAM、OCT4、CD44和CD133是肝癌干細胞最基本的分子標志物，與肝癌細胞侵襲，轉移等活動密切相關。因此，如何開發以肝癌干細胞為靶點的抗腫瘤藥物是治療肝癌的重要契機。然而，由于肝癌干細胞在肝癌組織中的分布比例很低，因此如何體外培養肝癌干細胞，成為了肝癌干細胞技術發展亟待解決的問題。近年來，三維細胞培養技術日漸成熟。三維培養技術是指將具有三維結構的載體與細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體支架的立體空間中遷移、生長，構成具有三維結構特征的細胞-載體復合物。目前，三維細胞培養技術在腫瘤生物學，軟骨和骨組織，循環系統和心臟，神經系統等領域都得到了廣泛應用，擴大了生物醫學研究的廣度和深度。傳統的二維細胞培養系統由于細胞在體外培養條件下生長逐漸喪失了原有的性狀，往往和生物體內情況不相符，而動物實驗受到體內外多種復雜因素共同影響，難以研究單一因素調控機制。三維細胞培養技術則介于二維細胞培養與動物實驗之間的一種新型技術，能夠最大程度的模擬體內環境，又能展現細胞培養的直觀性及條件可控性。
技術實現思路
專利技術目的：本專利技術的第一個目的是提供了一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法。本專利技術的另一目的是提供了誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法獲得的肝癌干細胞。本專利技術的另一目的是提供了肝癌干細胞在抗腫瘤藥物的體外篩選或腫瘤細胞體外藥敏實驗中的應用。技術方案：為了解決上述問題，本專利技術提供了一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法，包括以下步驟：1)將獲得單細胞狀態的人肝癌細胞，加入培養基中，制成細胞懸液；2)將細胞懸液滴加到多孔纖維素支架上，待細胞懸液滲入到多孔纖維素支架內部，置于細胞培養箱中培養貼附后再加入培養基，再置于細胞培養箱中培養數日，得到三維培養細胞；3)使用WesternBlot、RT-PCR、流式細胞術和IHC，測定三維培養細胞中的肝腫瘤干細胞標志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表達情況的變化，并使用顯微鏡觀察方法檢測轉化所得肝癌干細胞。其中，上述多孔纖維素支架以纖維素為主要材料，或以纖維素為主輔以其它生物相容性較好的各種生物材料。其中，上述纖維素材料可為甲基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙甲基纖維素及纖維素醚酯類材料。其中，上述多孔纖維素支架可用溶液澆注/粒子瀝濾法制備，亦可用熔融沉積法、3D打印技術及立體光刻法等制備所得。其中，上述多孔纖維素支架為互通多孔的海綿狀載體，孔徑為50～500μm。其中，上述多孔纖維素支架的孔徑優選為50-200μm。該孔徑分布均勻，細胞易于進入孔中，并為生長為細胞微球提供空間。其中，上述多孔纖維素支架剛度為5～100kPa。其中，上述多孔纖維素支架剛度優選為5～30kPa。其中，上述肝癌細胞為HepG2、HUH7、PLC/PRF/5或其它類型肝癌細胞。其中，上述培養基為肝癌細胞系培養時所用相應培養基或不含血清的腫瘤干細胞培養基。其中，上述培養條件為溫度35-39℃，氧氣含量3％-21％，二氧化碳5％。本專利技術的內容還包括采用上述的方法轉化得到的肝癌干細胞。本專利技術的內容還包括將上述的肝癌干細胞在抗腫瘤藥物的體外篩選或腫瘤細胞體外藥敏實驗中的應用。有益效果：相對于現有技術，本專利技術具有以下優點：1、本專利技術采用多孔纖維素支架對人肝癌細胞進行三維培養，直接獲得肝癌干細胞微球，所得微球細胞含大量EpCAM，OCT4，CD44和CD133陽性細胞，明顯具有肝癌干細胞的特性。2、本專利技術的誘導方法操作簡便，無需對細胞進行復雜的預處理，不會對細胞造成附加的物理化學壓力，細胞處于正常生理狀態。3、本專利技術的誘導分化方法能最大程度的誘導肝癌細胞轉化為肝癌干細胞，為肝癌的診斷和治療提供新的思路。本專利技術方法得率高，時效快，且可不使用商品化干細胞培養產品，降低價格成本。4、本專利技術的誘導轉化方法中使用多孔纖維素支架，可以為細胞提供三維生長環境，模擬體內的微環境。5、本專利技術獲得的肝癌干細胞對5-FU及順鉑具有很好的耐藥特性，可用于抗腫瘤藥物藥敏測試。附圖說明圖1WesternBlot技術檢測二維和三維培養的HepG2、HUH7、PLC/PRF/5細胞中EpCAM，OCT4，CD44和CD133的蛋白表達水平；圖2Realtime-PCR技術檢測二維和三維培養的HepG2、HUH7細胞中EpCAM和OCT4mRNA表達水平；圖3IHC技術檢測二維和三維培養的HepG2和HUH7細胞中EpCAM和CD44表達水平；圖4流式細胞術檢測二維和三維培養的HepG2細胞中CD44和CD133的表達水平；圖5流式細胞術檢測二維和三維培養的PLC/PRF/5細胞中CD44和CD133的表達水平；圖6顯微鏡在明場條件下觀察實施例1的二維和三維培養的HepG2和HUH7細胞。圖7二維和三維培養的肝癌細胞PLC/PRF/5細胞的耐藥實驗；圖8二維和三維培養的肝癌細胞HepG2細胞的耐藥實驗。具體實施方式下面對本專利技術作更進一步的說明。實施例1：一種誘導肝臟腫瘤細胞向腫瘤干細胞轉化的方法1)將生長狀態良好，處于對數生長期的肝癌細胞(HepG2，HUH7和PLC/PRF/5)用0.25％胰酶消化，于37℃消化5min，獲得單細胞狀態的人肝癌細胞，去除含胰酶的消化液后，加入含10％胎牛血清的DMEM完全培養基中，制成細胞懸液；2)將適量細胞懸液平鋪于細胞培養皿中，置于37℃，5％CO2，20％氧氣含量，細胞培養箱培養7天，作為二維培養細胞對照。隔天更換DMEM完全培養基；其中，所述DMEM完全培養基為添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養基。3)將60μl細胞懸液(細胞密度為105個/ml)滴加在多孔纖維素支架上，置于37℃，5％CO2，20％氧氣，細胞培養箱中4小時貼附后加入DMEM完全培養基，置于37℃，5％CO2，20％氧氣，培養箱培養7天，得三維培養細胞。隔天更換培養基。該多孔纖維素支架的纖維素主要為甲基纖維素，孔徑為50μm，剛度為15kPa；4)分別收集二維和三維培養得到的細胞，使用WesternBlot，RT-PCR，流式細胞術和IHC等方法，測定二維或三維培養條件下，肝癌細胞標志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表達情況的變化，并以顯微鏡觀察三維培養細胞表征變化。實施例2一種誘導肝臟腫瘤細胞向腫瘤干細胞轉化的方法1)將生長狀態良好，處于對數生長期的肝癌細胞(HepG2，HUH7和PLC/PRF/5)用0.25％胰酶消化，于37℃消化5min，獲得單細胞狀態的人本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法，其特征在于，包括以下步驟：1）將獲得單細胞狀態的人肝癌細胞，加入培養基中，制成細胞懸液；2）將細胞懸液滴加到多孔纖維素支架上，待細胞懸液滲入到多孔纖維素支架內部，置于細胞培養箱中培養貼附后再加入培養基，再置于細胞培養箱中培養數日，得到三維培養細胞；3）使用Western?Blot、RT?PCR、流式細胞術和IHC判斷三維培養細胞中的肝癌干細胞標志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表達情況的變化以及通過顯微鏡觀察方法檢測轉化所得肝癌干細胞。

【技術特征摘要】
1.一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法，其特征在于，包括以下步驟：1）將獲得單細胞狀態的人肝癌細胞，加入培養基中，制成細胞懸液；2）將細胞懸液滴加到多孔纖維素支架上，待細胞懸液滲入到多孔纖維素支架內部，置于細胞培養箱中培養貼附后再加入培養基，再置于細胞培養箱中培養數日，得到三維培養細胞；3）使用WesternBlot、RT-PCR、流式細胞術和IHC判斷三維培養細胞中的肝癌干細胞標志分子EpCAM、OCT4、CD44和CD133表達情況的變化以及通過顯微鏡觀察方法檢測轉化所得肝癌干細胞。2.根據權利要求1所述的一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法，其特征在于，所述多孔纖維素支架以纖維素為主要材料，或以纖維素為主輔以其它生物相容性較好的各種生物材料。3.根據權利要求1所述的一種誘導肝癌細胞向肝癌干細胞轉化的方法，其特征在于，所述多孔纖維素支架為互通多孔的海綿狀載體，內部孔徑為50~50...

【專利技術屬性】
技術研發人員：巫國誼，丁義濤，莊永傑，詹珊珊，
申請(專利權)人：南京鼓樓醫院，
類型：發明
國別省市：江蘇,32