人工多能性干細胞的制造方法技術

本發明專利技術的目的在于提供一種侵襲性低、且高效率地制造iPS細胞的方法。通過如下方法可以高效率地制造iPS細胞，該方法包括：在抗CD3抗體的存在下將來自周邊血的單核細胞群培養3天-14天的步驟；以及對所培養的單核細胞群進行脫分化處理的步驟。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種。
技術介紹
人工多能性干細胞(iPS細胞)用于對各種疾病的移植療法中，并期待其應用于再生醫療中。近年來有報告:通過從在成纖維細胞或肝細胞等體細胞中導入0ct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、及c-Myc基因并表達的細胞中，選擇表達Fbxl5基因的細胞，可以制作iPS細胞(例如參照:W02007/069666國際公開公報、TakahashiK, YamanakaS.(2006).“Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonicand adultfibroblast cultures by defined factors，，.Cell 126:663-676 ;Takahashi K, OkitaK, Nakagawa M, Yamanaka S.(2007).“Inductionof pluripotent stem cells fromfibroblast cultures”.Nature Protocols 2:3081-3089 ；Aoi T,Yae K, NakagawaM, Ichisaka T, Okita K, TakahashiK, Chiba T, Yamanaka S.(2008).“Generation ofpluripotent stem cellsfrom adult mouse liver and stomach cells，，.Science321(5889):699-702)。
技術實現思路
專利技術要解決的課題然而，在現有的iPS細胞制 作方法中，需要采集皮膚或肝臟等組織，因此病人的負擔大且iPS細胞制作效率也低。因此，本專利技術的目的在于提供一種侵襲性低、且高效率地制造iPS細胞的方法。解決課題的方法本專利技術的人工多能性干細胞(iPS細胞)的制造方法的特征在于:將來自周邊血的單核細胞群作為原料。所述iPS細胞的制造方法優選包括:(I)在抗⑶3抗體及白細胞介素2的存在下，將來自周邊血的單核細胞群培養3天-14天的步驟；以及(2)對培養后的所述單核細胞群進行脫分化處理的步驟。另外更優選在步驟(2)中，對所述單核細胞群進行脫分化因子的導入操作。在所述脫分化因子的導入操作中，也可以進行表達所述脫分化因子的重組表達載體的導入操作。此處優選脫分化因子為Sox2、0ct3/4、Klf4及c_Myc,更優選重組表達載體為仙臺病毒載體。本專利技術的iPS細胞的制造方法優選進一步包括:(3)在生長因子的存在下，將進行了脫分化處理的所述單核細胞群培養14天-25天的步驟。另外優選周邊血來自人類。另外，本說明書中不附加“基因”、“ cDNA ”等，而以稱為“ Sox2 ”、“ Oc 13/4 ”、“ Kl f 4 ”、“c-Myc”的方式僅使用因子名時，是指這些基因的基因產物即蛋白質。==相互參照==本申請案主張基于2010年4月16日提出申請的日本專利申請2010-95404的優先權，通過引用該基礎申請案，而將其包含在本說明書中。附圖說明圖1是表示在本專利技術的一個實施例中，在CD3抗體存在下培養的單核細胞群的培養基中，以MOI 1-20添加病毒對單核細胞群進行脫分化處理，由此獲得的堿性磷酸酶陽性干細胞的菌落率的圖表。圖2是在本專利技術的一個實施例中，由通過堿性磷酸酶染色及DAPI染色而染色的來自周邊血的單核細胞制造的iPS細胞的顯微鏡照片。圖3是在本專利技術的一個實施例中，由來自周邊血的單核細胞制造的iPS細胞中的干細胞標記蛋白質的免疫組織化學性染色的照片。圖4是在本專利技術的一個實施例中，通過RT-PCR對由周邊血單核細胞制造的iPS細胞中的干細胞標記基因的表達進行解析的結果。圖5是在本專利技術的一個實施例中，對通過FACS選出的T細胞以MOI 20添加病毒對單核細胞群進行脫分化處理而獲得的堿性磷酸酶陽性干細胞的菌落數(比較例)，與實施例中以MOI 20進行脫分化處理而得的菌落數(實施例)進行比較的圖表。圖6是表示本專利技術的一個實施例中，在抗CD3抗體及白細胞介素2的存在下培養單核細胞群而制作iPS細胞的情形(抗⑶3 + IL2 +群)，與不存在抗⑶3抗體及白細胞介素2下培養單核細胞群而制作iPS細胞的情形(抗⑶3-1L2-群)時的iPS建立效率的圖表。具體實施例方式以下，一邊列舉實施例，一邊詳細地說明根據所述發現而完成的本專利技術的實施方案。 在未對實施方案及實施例進行特別說明的情況下，是使用J.Sambrook, E.F.Fritsch&T.Maniatis(Ed.) , Molecular cloning,alaboratory manual(3rdedition), Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, New York (2001) ；F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons Ltd.等標準性方案集所記載的方法、或者將其加以修改、或改變的方法。另外，在使用市售的試劑盒或測定裝置時，在無特別說明的情況下，使用它們所隨附的實驗手冊。 另外，本專利技術的目的、特征、優點、及其意圖，是通過本說明書的記載而為本領域的技術人員所知曉，根據本說明書的記載，若是本領域的技術人員，則可以容易地再現本專利技術。以下所記載的專利技術的實施方案及具體的實施例等表示本專利技術的優選的實施方案，是為了例示或說明而表示，且本專利技術并不限定于這些實施方案及具體的實施例。本領域的技術人員明白，在本說明書所揭示的本專利技術的意圖以及范圍內，根據本說明書的記載，可以進行各種修改。以下，詳細敘述將來自周邊血的單核細胞群作為材料來制造iPS細胞的方法。周邊血優選來自哺乳動物，可以來自小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、羊、馬、豬、貓、狗、猴等動物，更優選來自人類。這些動物的成長階段可以是成體、幼體、胎兒、胚胎的任意一種，在可以獲得包含單核細胞的周邊血的范圍內并無限制。至于采血方法，考慮到動物體型的大小或采血量，從本領域的技術人員眾所周知的方法中適當選擇即可，并無特別限制，為了減輕動物的負擔，優選使用注射器采血。另外，將通過本專利技術的方法制造的iPS細胞用于治療患有某種疾病的病人或病獸時，周邊血優選來自與病人或病獸同種的動物，更優選來自病人或病獸本身。單核細胞群可以和單核細胞以外的來自周邊血的細胞或成分混合在一起，也可以僅包含單核細胞，但若考慮到iPS細胞的制造效率，則優選以高比例包含單核細胞。至于由周邊血制備單核細胞群的方法，本領域的技術人員可以從眾所周知的方法中適當選擇，例如可以使用:密度梯度離心法、淋巴細胞分離(LYMPH0 KWIK)法(One Lambda公司)、免疫磁珠法等。作為密度梯度離心法的比重液，例如本領域的技術人員從蔗糖溶液或聚蔗糖溶液、或者聚鹿糖-碘酞葡胺(Ficoll-Conray)、聚鹿糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)等鹿糖與表氯醇的水溶性共聚物本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.04.16 JP 2010-0954041.一種人工多能性干細胞的制造方法，其特征在于:將來自周邊血的單核細胞群作為原料。2.權利要求1所述的人工多能性干細胞的制造方法，其特征在于包括: (1)在抗CD3抗體及白細胞介素2的存在下，將來自周邊血的單核細胞群培養3天-14天的步驟； (2)對培養后的所述單核細胞群進行脫分化處理的步驟。3.權利要求2所述的人工多能性干細胞的制造方法，其特征在于: 在所述步驟(2)中，對所述單核細胞群進行脫分化因子的導入操作。4.權利要求3所述 的人工多能性干細胞的制造方法，其特征在于: 在所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：福田惠一，湯淺慎介，關倫久，長谷川護，
申請(專利權)人：學校法人慶應義塾，生物載體株式會社，
類型：
國別省市：