產(chǎn)生自然殺傷細(xì)胞的方法技術(shù)

本文提供了使用兩步擴(kuò)增和分化方法產(chǎn)生自然殺傷細(xì)胞的方法。本文還提供了抑制腫瘤細(xì)胞增殖、治療患有癌或病毒感染的個(gè)體的方法，包括將通過(guò)所述方法產(chǎn)生的NK細(xì)胞施用給患有癌或病毒感染的個(gè)體。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】
本文提供了產(chǎn)生自然殺傷細(xì)胞群體的方法，例如，來(lái)源于胎盤(pán)的自然殺傷細(xì)胞，例如，來(lái)源于胎盤(pán)灌洗液(例如，人胎盤(pán)灌洗液)，如胎盤(pán)源中間體自然殺傷細(xì)胞，或者來(lái)源于其他組織，例如，臍帶血或外周血。本文還提供了通過(guò)本文所提供的方法產(chǎn)生的擴(kuò)增的自然殺傷細(xì)胞群體。本文還提供了使用胎盤(pán)灌洗液以及來(lái)自所述胎盤(pán)灌洗液的自然殺傷細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法。在某些實(shí)施方式中，將所述自然殺傷細(xì)胞與一種或多種免疫調(diào)節(jié)化合物(例如，稱為IMiD 的免疫調(diào)節(jié)化合物)組合使用或用所述一種或多種免疫調(diào)節(jié)化合物處理。3.
技術(shù)介紹
自然殺傷(NK)細(xì)胞是構(gòu)成天然免疫系統(tǒng)的主要部分的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞不表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig) B細(xì)胞受體。NK細(xì)胞通常在人中表達(dá)表面標(biāo)志物⑶16 (FcyRIII)和⑶56，但人NK細(xì)胞的亞類為⑶16。NK細(xì)胞是細(xì)胞毒性的；它們細(xì)胞質(zhì)中的微粒含有特殊的蛋白質(zhì)，如穿孔素和被稱為顆粒酶的蛋白酶。一旦在要?dú)陌屑?xì)胞附近釋放，則穿孔素在所述靶細(xì)胞的細(xì)胞膜中形成孔，通過(guò)該孔顆粒酶和結(jié)合分子可以進(jìn)入，從而引起細(xì)胞凋亡。一種顆粒酶，顆粒酶B (也稱為顆粒酶2和細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞相關(guān)絲氨酸酯酶1)，是對(duì)于在細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)中快速引起靶細(xì)胞細(xì)胞凋亡來(lái)說(shuō)至關(guān)重要的絲氨酸蛋白酶。NK細(xì)胞對(duì)干擾素或者巨噬細(xì)胞源細(xì)胞因子響應(yīng)而被激活。激活的NK細(xì)胞稱為淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞。NK細(xì)胞具有控制細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的兩種表面受體類型(標(biāo)記為“激活受體”和“抑制受體”)。除了活性，NK細(xì)胞在宿主腫瘤排斥中起作用。由于癌細(xì)胞的I類MHC表達(dá)降低或無(wú)表達(dá)，因此它們可以成為NK細(xì)胞的靶標(biāo)。積累的臨床數(shù)據(jù)表明分離自外周血單核細(xì)胞(PBMC)或骨髓的人NK細(xì)胞的單倍同一性移植介導(dǎo)了有效力的抗白血病作用而不會(huì)導(dǎo)致可檢測(cè)的移植物抗宿主病(GVHD)。參見(jiàn)Ruggeri等人，Science295:2097-2100 (2002)。自然殺傷細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞缺少或顯示出降低水平的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白而被激活。另外，已知NK細(xì)胞上表達(dá)的激活受體介導(dǎo)了具有激活受體表達(dá)配體的“應(yīng)激”或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的檢測(cè)，并因此引起了 NK細(xì)胞的激活。例如，NCRl (NKp46)結(jié)合病毒血球凝集素。NKG2D配體包含CMV UL16結(jié)合蛋白I (ULB1 )、ULB2，ULB3和MHC I類多肽相關(guān)序列A(MICA)和MICB蛋白。NK蛋白2B4結(jié)合⑶48，并且DNAM-1結(jié)合脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(PVR)和連接素2 (Nectin-2)，兩者均在急性骨髓性白血病(AML)中持續(xù)檢測(cè)到。參見(jiàn)Penda等人，Bloodl05:2066-2073 (2004)。參見(jiàn)Marrobio等，此外，已說(shuō)明AML的溶胞主要是自然細(xì)胞毒性受體(NCR)依賴性的。參見(jiàn)Fauriat等人，Bloodl09:323-330 (2007)。激活并擴(kuò)增的來(lái)源于外周血的NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞已在晚期癌患者的離體療法和體內(nèi)治療中使用，并且對(duì)骨髓相關(guān)疾病，如白血病；乳腺癌；和某些類型的淋巴瘤取得了一定的成功。LAK細(xì)胞治療需要患者首先接受IL-2，隨后進(jìn)行白細(xì)胞去除術(shù)，然后將收獲的自體同源性血細(xì)胞在存在IL-2的情況下培育和培養(yǎng)幾天。必須將LAK細(xì)胞與相對(duì)高劑量的IL-2 —起再輸注以完成所述療法。這種凈化治療(purging treatment)是昂貴的并可以導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。這些包括體液潴留、肺水腫、血壓降低和高燒。雖然NK細(xì)胞在殺死腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞中具有有利性能，但是它們?nèi)噪y以與免疫療法一起使用和在免疫療法中應(yīng)用，這主要是由于在培養(yǎng)和擴(kuò)增期間難以維持它們的腫瘤靶向和殺腫瘤能力。因此，在本領(lǐng)域中需要發(fā)展產(chǎn)生和擴(kuò)增保留殺腫瘤功能的自然殺傷細(xì)胞的有效方法。4.
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本文提供了將細(xì)胞，例如，造血細(xì)胞，如造血干細(xì)胞，例如，⑶34+造血干細(xì)胞，擴(kuò)增和分化為自然殺傷細(xì)胞的方法。在一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生自然殺傷(NK)細(xì)胞的方法，包括在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，CD34+干細(xì)胞或祖細(xì)胞以產(chǎn)生擴(kuò)增和分化的細(xì)胞，并隨后在其中所述細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增并分化成自然殺傷細(xì)胞的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述擴(kuò)增的細(xì)胞。該第一步驟和第二步驟包括在具有細(xì)胞因子獨(dú)特組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞因子(例如，細(xì)胞因子)不包含在培養(yǎng)基不明確的組分(例如，血清)中，例如，細(xì)胞因子(例如，細(xì)胞因子)對(duì)于培養(yǎng)基不明確的組分(例如，血清)來(lái)說(shuō)是外源的。在某些實(shí)施方式中，所述方法是兩步法。在某些實(shí)施方式中，該方法不包括其中接觸細(xì)胞的任何第三步驟或中間步驟。在具體的實(shí)施方式中，本文提供了產(chǎn)生激活的自然殺傷(NK)細(xì)胞群體的方法，其包括:(a)將造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體接種到包含白細(xì)胞介素-15 (IL-15)并可選地包含干細(xì)胞因子(SCF)和白細(xì)胞介素-7 (IL-7)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中，其中所述IL-15和可選的SCF和IL-7不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，從而所述群體擴(kuò)增并且所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體內(nèi)的多個(gè)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述擴(kuò)增期間分化為NK細(xì)胞；和(b)將來(lái)自第一步驟的細(xì)胞在包含白細(xì)胞介素-2( IL-2)的第二培養(yǎng)基中擴(kuò)增，以產(chǎn)生激活的NK細(xì)胞群體。通過(guò)本文所提供的方法(例如，兩步法)產(chǎn)生的自然殺傷細(xì)胞在本文中被稱為T(mén)SNK細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述第一培養(yǎng)基包括含有人血清(例如，人血清AB)、胎牛血清(FBS)或胎牛血清(FCS)，例如，5%至20%(v/v);干細(xì)胞因子(SCF)，例如，Ing/mL至50ng/mL ；FMS樣酪氨酸激酶_3配體(Flt-3配體)，例如，Ing/mL至20ng/mL ;白細(xì)胞介素_7 (IL-7)，例如，Ing/mL至50ng/mL ;促血小板生成素(ΤΡ0),例如，Ing/mL與50ng/mL ;白細(xì)胞介素_2(IL-2)，例如，50IU/mL 至 500IU/mL ;白細(xì)胞介素-15 (IL-15)，例如，Ing/mL 至 50ng/mL ;和/或肝素，例如，0.lIU/mL至10IU/mL中一種或多種的培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素-7 (IL-7)和白細(xì)胞介素-15 (IL-15)。在另一種具體的實(shí)施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基、人血清(例如，人血清AB)、FBS、FCS、SCF、IL-7和IL-15。在另一種具體的實(shí)施方式中，所述第一培養(yǎng)基還包含F(xiàn)lt_3配體(Flt3-L)、TPO、IL-2和/或肝素。在另一種具體的實(shí)施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基、10%的人血清或者胎牛血清、20ng/mL的SCF、10ng/mL的Flt3_L、20ng/mL的IL-7、20ng/mL 的 TP0、200IU/mL 的 IL_2、10ng/mL 的 IL-15 和 1.5IU/mL 的肝素。在另一種具體的實(shí)施方式中，所述第一培養(yǎng)基不包含IL-2。在另一種具體的實(shí)施方式中，在所述第一培養(yǎng)基中的所述培養(yǎng)包括使用飼養(yǎng)細(xì)胞，例如，K562細(xì)胞，例如，絲裂霉素C處理的K562細(xì)胞；夕卜周血單核細(xì)胞(PBMC)，例如，絲裂霉素C處理的P本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2010.07.13 US 61/363,981;2011.06.16 US 61/497,8971.種產(chǎn)生激活的自然殺傷(NK)細(xì)胞群體的方法，包括: Ca)將造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體接種到包含白細(xì)胞介素-15 (IL-15)并可選地包含干細(xì)胞因子(SCF)和白細(xì)胞介素-7 (IL-7)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中，其中所述IL-15和可選的SCF和IL-7不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，從而所述群體擴(kuò)增并且所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體內(nèi)的多個(gè)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述擴(kuò)增期間分化為NK細(xì)胞；和 (b )將來(lái)自步驟(a)的所述細(xì)胞在包含干擾白細(xì)胞素-2 (IL-2)的第二培養(yǎng)基中擴(kuò)增，以產(chǎn)生激活的NK細(xì)胞群體。2.種產(chǎn)生激活的自然殺傷(NK)細(xì)胞群體的兩步法，其中，所述方法的第一步包括在包含干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素-7 (IL-7)和白細(xì)胞介素-15 (IL-15)中的一種或多種的第一培養(yǎng)基中擴(kuò)增造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培養(yǎng)基的不明確的組分中，并且其中所述造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞群體內(nèi)的多個(gè)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞在所述擴(kuò)增期間分化為NK細(xì)胞；和 其中所述方法的第二步包括在包含干擾白細(xì)胞素-2 (IL-2)的第二培養(yǎng)基中擴(kuò)增來(lái)自所述第一步的細(xì)胞，以產(chǎn)生激活的NK細(xì)胞。3.據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一培養(yǎng)基還包含F(xiàn)ms樣酪氨酸激酶3配體(Flt3-L)、促血小板生成素(Τρο)、白細(xì)胞介素-2 (IL-2)或肝素中的一種或多種。4.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述第一培養(yǎng)基還包含胎牛血清或人血清。5.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述SCF在所述第一培養(yǎng)基中以約I至約150ng/mL的濃度存在。6.據(jù)權(quán)利要求3所述的 方法，其中，所述Flt3-L在所述第一培養(yǎng)基中以約I至約150ng/mL的濃度存在。7.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述IL-2在所述第一培養(yǎng)基中以約50至約1500IU/mL的濃度存在。8.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述IL-7在所述第一培養(yǎng)基中以約I至約150ng/mL的濃度存在。9.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述IL-15在所述第一培養(yǎng)基中以約I至約150ng/mL的濃度存在。10.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述Tpo在所述第一培養(yǎng)基中以約I至約150ng/mL的濃度存在。11.據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述肝素在所述第一培養(yǎng)基...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：羅伯特·J·哈黎里，穆罕默德·A·黑德蘭，斯蒂芬·亞什科，康琳，埃里克·勞，阿賈伊·帕爾，芭娃妮·斯托特，瓦內(nèi)薩·沃斯基納里安貝爾斯，安德魯·查特林，張小葵，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：人類起源公司，
類型：
國(guó)別省市：