高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株制造技術(shù)

高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，它涉及一種基因工程細(xì)胞株。解決現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因工程菌株芋螺毒素分泌表達(dá)量低，且需要在發(fā)酵上清液中加入β-巰基乙醇再透析過夜，導(dǎo)致成本高，生產(chǎn)周期長，風(fēng)險(xiǎn)增加，不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的問題。將人工設(shè)計(jì)的CTx基因與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His-C重組構(gòu)建的表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-C-CTx與含有dhfr基因的質(zhì)粒pDCH1P11共轉(zhuǎn)染入CHO-dhfr-，獲得高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。本發(fā)明專利技術(shù)可用于醫(yī)藥領(lǐng)域。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種基因工程細(xì)胞株。
技術(shù)介紹
芋螺(Conus)多數(shù)生活在熱帶海洋的淺水區(qū)，種類繁多，目前發(fā)現(xiàn)的芋螺有500多種，根據(jù)其不同種的外形、花紋及色澤等進(jìn)行命名和分類。捕食時(shí)，它們會(huì)向獵物投射接連毒腺管和毒囊的針狀齒舌，并注射毒液，獵物一旦被擊中，就立刻麻痹，成為芋螺的食物，這種毒液的主要成分便是芋螺毒素(conotoxin，CTx)。芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一類來源于芋螺毒液的活性多肽。芋螺毒素通常是由1(Γ46個(gè)氨基酸殘基組成，分子量小，結(jié)構(gòu)多樣，富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架，主要作用于鈉、鉀、鈣等多種離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體，阻斷或增強(qiáng)神經(jīng)興奮信號的傳遞，是迄今發(fā)現(xiàn)分子量最小的一類多肽毒素。芋螺毒素具雙重效應(yīng)，一方面阻斷痛覺傳遞而具鎮(zhèn)痛效應(yīng)，另一方面抑制興奮毒性(excitotxic)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，阻止神經(jīng)元細(xì)胞病理性鈣內(nèi)流而有神經(jīng)保護(hù)作用。因其直接作用于鈣通道，無需第二信使或G蛋白，故不成癮， 將成為慢性重癥疼痛如晚期惡性腫瘤和AIDS病，取代用阿片類成癮的神經(jīng)性疾病的新一代藥物。芋螺毒素因生物活性強(qiáng)，作用靶點(diǎn)廣且具有高度選擇性，可直接作用藥物，又可以作為設(shè)計(jì)新藥的先導(dǎo)化合物，具有重要的理論研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。但是從芋螺體內(nèi)獲得芋螺毒素的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需要，因此利用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得表達(dá)芋螺毒素的工程菌株成為發(fā)展的的趨勢。但是目前所知的轉(zhuǎn)基因工程菌株都存在芋螺毒素分泌表達(dá)量低的缺陷，而且有研究表明ω-芋螺毒素中只有天然二硫鍵的形成才能促使進(jìn)一步正確的折疊。因此，如何保證轉(zhuǎn)基因后芋螺毒素的二級結(jié)構(gòu)，保持其生物活性，成為困擾芋螺毒素轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)的一大難題。現(xiàn)有的芋螺毒素重組菌(或轉(zhuǎn)基因菌株)都采用在發(fā)酵上清液中加入β_巰基乙醇將二硫鍵打開，然后再透析過夜使其在空氣中緩慢氧化，最終形成正確的二硫鍵配對形式。但這種方式不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且成本高，生產(chǎn)周期長，也許存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因工程菌株芋螺毒素分泌表達(dá)量低，且需要在發(fā)酵上清液中加入β -巰基乙醇再透析過夜，導(dǎo)致成本高，生產(chǎn)周期長，風(fēng)險(xiǎn)增加，不適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的問題，而提供的一株高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。本專利技術(shù)高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株按以下步驟制備一、設(shè)計(jì)宇螺毒素轉(zhuǎn)基因序列，基因序列如SEQ ID Ν0:1所不；二、合成芋螺毒素轉(zhuǎn)基因DNA片段，然后導(dǎo)入T載體中；三、目的片段雙酶切，用BamHI及EcoR I雙酶切消化T載體，反應(yīng)體系為40.2pg&L T 載體 IOx M buffer本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，其特征在于高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株按以下步驟制備：一、設(shè)計(jì)芋螺毒素轉(zhuǎn)基因序列，基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；二、合成芋螺毒素轉(zhuǎn)基因DNA片段，然后導(dǎo)入T載體中；三、目的片段雙酶切，用BamHI及EcoRⅠ雙酶切消化T載體，反應(yīng)體系為酶切反應(yīng)條件為37℃放置10h，然后將酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到插入片段CTx；四、質(zhì)粒載體雙酶切：用BamHI和EcoRⅠ雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3.1/V5?His?C，反應(yīng)體系為酶切反應(yīng)條件為37℃放置10h，然后將酶切產(chǎn)物用0.6%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到酶切后的載體pcDNA3.1/V5?His?C；五、插入片段CTx與經(jīng)過雙酶切的載體pcDNA3.1/V5?His?C連接，連接反應(yīng)體系為連接反應(yīng)條件為16℃放置過夜，獲得連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒pcDNA3.1/V5?His?C?CTx；六、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/V5?His?C?CTx與質(zhì)粒pDCH1P11 混合，使用LipofeetmineTM?2000?Reagent共轉(zhuǎn)染CHO?dhfr?細(xì)胞，在24孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞達(dá)到95%融合時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無抗生素、無血清的CHO?S?SFMⅡ，500μL/孔，轉(zhuǎn)染6h后更換含100mL/L?FBS、不含HT和NAA的CHO?S?SFMⅡ，繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ELISA試劑盒鑒定陽性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按1:10傳代，24h細(xì)胞貼壁后更換為不含HT和NAA、含G418??0.75mg/L和FBS?100mL/L的選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)14～16d后有陽性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽性克隆轉(zhuǎn)入24孔板，又傳代至12孔板，經(jīng)?ELISA試劑盒測定對陽性高表達(dá)的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；七、MTX的加壓培養(yǎng)：以MTX加壓篩選，濃度依次為2×10?8?mmol/L、1×10?7?mmol/L和5×10?7?mmol/L，最終得到能夠在5×10?7?mmol/L的MTX中正常生長的CHO細(xì)胞株，即為高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株。FDA0000257181211.jpg,FDA0000257181212.jpg,FDA0000257181213.jpg...

【技術(shù)特征摘要】
1.高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株，其特征在于高效分泌表達(dá)芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細(xì)胞株按以下步驟制備 一、設(shè)計(jì)宇螺毒素轉(zhuǎn)基因序列，基因序列如SEQID NO I所不； 二、合成芋螺毒素轉(zhuǎn)基因DNA片段，然后導(dǎo)入T載體中； 三、目的片段雙酶切，用BamHI及EcoRI雙酶切消化T載體，反應(yīng)體系為.0.2pg/pL T 載體20pLIOx M buffer6μΙ_,BamHl3μ KcoR I3p.LddH2028μ 酶切反應(yīng)條件為37°C放置10h，然后將酶切產(chǎn)物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT純化回收，得到插入片段CTx ； 四、質(zhì)粒載體雙酶切用BamHI和EcoRI雙酶切消化質(zhì)粒載體pcDNA3. l/V5-His_C，反應(yīng)體系為 .0.2pg/pL pcDNA3.l/V5-His-C20μ IOx M buffer6μBamHl3 pL ICcoR 丨3 pL ddH2028 pL 酶切反應(yīng)條件為37°C放置10h，然后將酶切產(chǎn)物用O. 6%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA GELEXTRACTION KIT純化回收，得到酶切后的載體pcDNA3. l/V5-His_C ； 五、插入片段CTx與經(jīng)過雙酶切的載體pcDNA3.1/V5-His-C連接，連接反應(yīng)體系為 Q2^gl\xL 酶切后載體 pcDNAU/VS-Hi...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：余瓊，
申請(專利權(quán))人：黑龍江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：