本發明專利技術公開了一種ChR2-GFP基因工程化神經干細胞株及其構建方法，所述細胞株為能穩定表達光敏感蛋白（ChR2）和綠色熒光蛋白（GFP）的重組C17.2神經干細胞株；通過構建重組慢病毒、轉導C17.2神經干細胞株以及篩選獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經干細胞株；本發明專利技術的細胞株可用于移植干細胞分化來源的神經元與宿主神經系統功能整合的在體及離體研究，為干細胞移植后分化來源的神經元與宿主神經系統功能整合的研究提供一個良好的平臺；本發明專利技術構建重組干細胞方法，尤其是利用濾紙片消化法，提高了GFP陽性細胞的比率，有利于流式FACS分選，大大提高了實驗效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥領域，特別涉及。
技術介紹
神經系統變性疾病是一類疾病，包括帕金森、阿爾茨海默等疾病，目前尚無有效、特異療法，干細胞移植替代療法具有良好的前景。移植入體內干細胞來源的神經元必須能與宿主神經系統存留的神經元之間建立有功能的突觸聯系，才能恢復突觸信息的傳遞。目前的多種研究只是在形態學方面提供了間接證據，尚未在功能上尤其是傳遞信息的突觸層面闡明該問題。光遺傳學技術的發展可以解決該問題。利用遺傳學技術使細胞表達光敏感蛋白，可實現對細胞功能的光學控制，斯坦福大學的Deisseroth教授等將這種結合光學和遺傳學結合的技術稱為光遺傳學技術。光敏感蛋白是能夠被光激活的一類膜蛋白，廣泛分布于原核生物、植物以及動物的視覺系統中，目前在光控神經元研究中廣泛應用的是光敏感蛋白(Channelrhodopsin-2,簡稱ChR2)。ChR2是從單細胞綠藻中分離出來的一種感光性膜表達陽離子通道蛋白，能夠通過基因轉染技術表達在神經元的細胞膜上，當在低能量470nm藍光瞬間(5-15ms)照射下，ChR2通道打開，Na+、Ca2+等陽離子進入胞內引起細胞去極化從而產生動作電位，而且不會影響神經元生物活性，因此是目前最常用的光敏感蛋白。通過基因轉染，使干細胞同時穩定表達ChR2_GFP，其中GFP (綠色熒光蛋白，英文為green fluorescent protein,簡稱GFP)用于示蹤干細胞,ChR2用于刺激細胞；移植入體內后，干細胞來源的神經元穩定表達ChR2和GFP，通過GFP示蹤其位置，同時470nm激光光刺激表達ChR2的干細胞分化來源神經元細胞，同時通過膜片鉗技術記錄宿主神經元的突觸后電流，研究移植干細胞來源的神經元與宿主神經元細胞的功能整合，為臨床干細胞移植治療變性疾病提供理論依據。然而，快速構建、篩選重組細胞株不是一件容易的事，提高重組基因工程化神經干細胞株的構建篩選效率也一直是重組干細胞實驗的重要內容之一，一種好的構建、篩選方法可以節省大量的人力、物力，并加快科學研究的步伐。
技術實現思路
鑒于此，本專利技術的目的是提供一種ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株，所述細胞株為能穩定表達光敏感蛋白(channelrhodopsin-2, ChR2)和綠色突光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)的重組 C17. 2 神經干細胞株。本專利技術的另一目的是提供一種構建ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株的方法，包括如下步驟第一步，重組慢病毒的構建和篩選接種293FT細胞于加有10%FBS+DMEM培養基的24孔板中，每孔細胞接種細胞數為I X IO5個，然后用慢病毒包裝質粒混合物和ChR2-GFP慢病毒表達質粒共轉染所述293FT細胞,24小時換為含1%FBS DMEM培養液，48小時5000rpm離心5min收集培養液上清，0. 45 u m的PVDF膜過濾所述上清得重組慢病毒液。以標準病毒液I X IO8Cfu / L為對照，將重組慢病毒液和標準病毒液按感染復數值分別設5個梯度1、3、5、10和20，感染293FT細胞并于24小時后根據綠色熒光細胞的強度和數量確定病毒滴度，當表達GFP的細胞超過95%、慢病毒液滴度達I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實驗。第二步，重組C17. 2神經干細胞株的構建和篩選C17. 2神經干細胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養基培養，在37°C、5%C02 6孔板細胞培養板培養細胞至50%融合時每孔更換Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養基，加入Iul所述重組慢病毒液，同時加入病毒感染輔助劑Polybrene使終濃度為8 u g/ml，轉染6小時后，換為DMEM培養基培養至細胞80%_90%貼壁時以密度2X IO4 / ml傳代至IOcm細胞培養皿中。在熒光顯微鏡下在所述IOcm細胞培養皿的底部標記表達GFP的細胞群，PBS清洗3遍后，將0. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經標記GFP的細胞群上面，370C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達GFP 0.5%比率的細胞，并以I個細胞/孔的密度傳至96孔板中。再通過免疫熒光雙標檢測和全細胞對光反應膜片鉗鑒定獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經干細胞株。本專利技術中，ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株可以同時穩定表達ChR2_GFP，且可以穩定傳代，并且470nm藍光刺激能引起細胞產生內向電流。本專利技術方法構建重組干細胞，尤其是利用濾紙片消化法提高了 GFP陽性細胞的比率，有利于流式(FACS)分選，提高了實驗效率。本專利技術的細胞株可用于移植干細胞分化來源的神經元與宿主神經系統功能整合的在體及離體研究，為干細胞移植后分化來源的神經元與宿主神經系統功能整合的研究提供一個良好的平臺。附圖說明圖I為本專利技術ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株的光學顯微鏡圖；圖2為本專利技術免疫熒光雙標檢測ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株表達ChR2-GFP蛋白和神經干細胞標記物Nestin蛋白的熒光圖；圖3為本專利技術全細胞對光反應膜片鉗鑒定ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株的對470nm藍光刺激反應能力的電流具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本專利技術，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本專利技術的應用范圍。本專利技術不限于下述實施方式或實施例，凡不違背本專利技術精神所做出的修改及變形，均應包括在本專利技術范圍之內。本專利技術構建ChR2_GFP基因工程化神經干細胞株實驗例第一步，重組慢病毒的構建和篩選接種293FT細胞于加有10%FBS+DMEM培養基的24孔板中，每孔細胞接種細胞數為I X IO5個，然后用慢病毒包裝質?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達質粒(購買于Addgene公司)共轉染293FT細胞；24小時換為含1%FBS DMEM培養液；48小時收集細胞，5000rpm離心5min, 0. 45 u m的PVDF膜過濾上清后用作待測病毒液(重組慢病毒液)；以標準病毒液IXlO8Cfu / L為對照，將待測病毒液和標準病毒液按感染復數值分別設5個梯度1、3、5、10和20，感染293T細胞并于24小時觀察綠色熒光細胞的強度和數量以確定病毒滴度，將表達GFP的細胞超過95%，病毒液滴度達I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實驗。 第二步，轉導C17. 2神經干細胞株，熒光活化細胞分選系統(fluorescenceactivated cell sorting,簡稱FACS)篩選穩轉細胞株C17. 2神經干細胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養基培養，在37°C、5%C02 6孔板細胞培養板培養細胞至50%左右融合，首先換為lmllO%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養基，再取Iul (I.OX IO8Cfu / L)含有ChR2_GFP基因的慢病毒加入培養液 中，同時加入病毒感染輔助劑Polybrene(終濃度8本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種ChR2?GFP基因工程化神經干細胞株，其特征在于：所述細胞株為能穩定表達光敏感蛋白（ChR2）和綠色熒光蛋白（GFP）的重組C17.2神經干細胞株。
【技術特征摘要】
1.一種ChR2-GFP基因工程化神經干細胞株，其特征在于所述細胞株為能穩定表達光敏感蛋白(ChR2)和綠色熒光蛋白(GFP)的重組C17. 2神經干細胞株。2.—種構建權利要求I所述的ChR2-GFP基因工程化神經干細胞株的方法，其特征在于包括如下步驟 第一步，重組慢病毒的構建和篩選 接種293FT細胞于加有10%FBS+DMEM培養基的24孔板中，每孔細胞接種細胞數為I X IO5個，然后用慢病毒包裝質粒混合物和ChR2-GFP慢病毒表達質粒共轉染所述293FT細胞,24小時換為含1%FBS DMEM培養液，48小時5000rpm離心5min收集培養液上清，O. 45 μ m的PVDF膜過濾所述上清得重組慢病毒液。以標準病毒液I X IO8Cfu / L為對照，將所述重組慢病毒液和標準病毒液按感染復數值分別設5個梯度1、3、5、10和20，感染293FT細胞并于24小時后根據綠色熒光細胞的強度和數量確定病毒滴度，當表達GFP的細胞超過95%、慢病毒液滴度達I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實驗。第二步，重組C17. 2神經干細胞株的構...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王少軍，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：
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