本發明專利技術公開一種基因工程雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF生產方法，包括下列步驟，S1：雜合肽CecA-Temporin-SHF基因合成；S2：雜合肽CecA-Temporin-SHF重組酵母表達載體的構建；S3：pPIC9K-CTS表達載體的轉化；S4：重組Pichia?pastoris的誘導表達。本雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF的生產方法工藝簡單、產量高。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術制藥工業中基因工程生產蛋白藥物領域，尤其涉及一種雜合抗菌肽CecA-Temporin-SHF(CTS)的生產方法。
技術介紹
目前養殖業中，由于抗生素泛濫使用，破壞動物腸道微生物菌群平衡，致使潛伏在體內的有害菌群大量繁殖會引起內源感染，并且還導致耐藥微生物產生，致使藥物劑量加大、治療周期延長、死亡率增高等問題，而且細菌的耐藥性還會向人類的轉移，給人類的健康造成巨大影響。抗菌肽被認為是新一代抗生素的理想替代者。抗菌肽是生物體內經誘導產生的一類具有生物學活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性及毒副作用等優點。隨著研究的不斷深入，越來越顯示出了其在醫學、獸醫學等相關領域的獨特應用價值。雜合抗菌肽CTS具有抗革蘭·氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌的能力，對耐藥細菌同樣具有較好抑制效果，同時具有良好熱穩定性和耐酸堿能力，這些特點使得雜合抗菌肽CTS在動物疾病防治和飼料添加劑等方面顯露出很好的應用前景。通過基因工程手段解決雜合抗菌肽CTS產量問題，減低抗生素使用量，為綠色養殖保駕護航。目前雜合抗菌肽CTS合成工藝復雜，獲取量少，無法滿足市場需求，提高雜合抗菌肽CTS產量是一個急需解決的問題。
技術實現思路
鑒于上述狀況，有必要提供一種工藝簡單、產量高的雜合抗菌肽CTS的生產方法。一種雜合抗菌肽CTS的生產方法，包括下列步驟，雜合妝CecA-Temporin-SHF 基因合成；根據GENBANK 成熟肽段 CecropinA 以(1-8)及 Temporin-SHF(1-8)的氨基酸序列(KWKLFKKIFFFLSRIF)，選用酵母偏愛密碼子設計CecA-Temporin-SHF(CTS)雜合肽基因，人工合成優化的CecA-Temporin-SHF雜合抗菌肽基因，CecA-Temporin-SHF雜合肽基因5’和3’端分別引入Eco RI> Not I內切酶位點；另合成一對引物Pl與P2，其中，Pl與P2的序列分別為P1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC, P2 :GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC，該引物 Pl 與P2用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，Pl位于畢赤酵母5’ AOX基因區，P2位于插入片段CecA-Temporin-SHF基因區，引物P1、P2的擴增長度分別為441bp ；雜合肽CecA-Temporin-SHF重組酵母表達載體的構建；PCR產物和pPIC9K均用Eco RI、Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E. coli DH5a，重組表達質粒進行PCR、缺失酶切位點鑒定，PCR以及酶切鑒定為陽性的質粒測序，構建正確的重組表達質粒命名為PPIC9K-CTS ；pPIC9K-CTS表達載體的轉化；感受態Pichia pastorisGS 115 (his/Mut+)與 SacI 線性化 pPIC9K_CTS (5ug)相混合，轉移至預冷的O. 2cm電轉杯中，置冰上5min，1.5kV、25uF、200Q電擊，立即加ImL預冷的lmol/L山梨醇，取200uL涂布于含G418(5. Og/L)的YPD平板上篩選轉化子，30°C孵化4 5d至平板出現乳白色的酵母轉化菌落；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉化子，用煮-凍-煮法制備PCR模板，以Pl，P2為引物，PCR反應條件-MV 5min ；94°C 45s,61。。45s, 72°C 45s，25個循環；72°C 5min。以能擴增出441bp的克隆定為陽性轉化子；重組Pichia pastoris的誘導表達；將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養約22h至0D600達到3-6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養基，進行誘導表達；28°C、250r/min培養60h，期間每24h補加終濃度為1% (V/V)的甲醇；72h后5000r/min離心IOmin ;收集培養液上清，即獲得雜合肽CecA-Temporin-SHF蛋白，分子量2. IKD,具有明顯抑菌活性。本專利技術采用pPIC9K/Pichia pastoris GSl 15系統，構建高效表達雜合抗菌肽CTS 基因工程菌株，大量獲得雜合抗菌肽CTS，為健康養殖、食品安全提供強有力的保障。附圖說明圖I是以重組質粒pPIC9K-CTS為模板，用P1、P2引物進行PCR擴增目的基因片段，所得電泳圖譜；圖2是重組質粒pPIC9K-CTS的酶切分析圖；圖3是重組菌株的PCR分析圖；圖4是表達蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；圖5是抑菌試驗對照圖。具體實施例方式本專利技術公開一種雜合抗菌肽CTS的生產方法，其詳細過程如下。雜合抗菌肽CTS序列的優化；外源基因的內在特性如密碼子偏好性是影響外源蛋白的有效表達重要因素。根據畢赤酵母密碼子偏好性，將雜合抗菌肽CTS基因的酵母低頻密碼子優化成高頻密碼子，以提高目的蛋白的翻譯速度和表達量。雜合抗菌肽CTS基因優化情況如下GAATTCAAAAGAAAGTGGAAGTTGTTCAAGAAGATCTTCTTCTTCTTGTCTAGAATCTTCCAATGAGCGGCCGC通過軟件分析，在基因序列的5’端和3’端分別加上EcoR I、Not I兩個酶切位點。雜合抗菌肽CTS基因序列的合成合成雜合抗菌肽CTS基因序列由人工完成。合成的雜合抗菌肽CTS基因全序列為GAATTCAAAAGAAAGTGGAAGTTGTTCAAGAAGATCTTCTTCTTCTTGTCTAGAATCTTCCAATGAGCGGCCGC畢赤酵母表達載體的構建設計引物根據新合成的序列設計上下游引物Pl，P2，新合成的引物序列如下Pl (5' AOXI) GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；P2 GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC雜合抗菌肽CTS基因的克隆首先以合成雜合抗菌肽CTS基因為模板，用Pl，P2引物進行PCR擴增。PCR反應體系如下權利要求1.，包括下列步驟， 51:雜合妝CecA-Temporin-SHF基因合成； 52:雜合肽CecA-Temporin-SHF重組酵母表達載體的構建； 53pPIC9K-CTS表達載體的轉化； 54:重組Pichia pastoris的誘導表達。2.如權利要求I所述的其中所述SI過程中包括根據GENBANK成熟肽段CecropinA以及Temporin-SHF的氨基酸序列，其序列號KWKLFKKIFFFLSRIF，選用酵母偏愛密碼子設計CecA-Temporin-SHF雜合肽基因，人工合成優化的CecA-Temporin-SHF雜合抗菌肽基因,CecA-Temporin-SHF雜合肽基因5’和3’端分別引入Eco RI> Not I內切酶位點；另合成一對引物Pl與P2，其中，Pl與P2的序列分別為P1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC, P2 GCGGCCGCTCATTGGAAGATTC,該引物 Pl 與P2用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，Pl位于畢赤酵母5’ AOX基因區，P2位于插入片段Cec本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基因工程雜合抗菌肽CecA?Temporin?SHF生產方法，包括下列步驟，S1：雜合肽CecA?Temporin?SHF基因合成；S2：雜合肽CecA?Temporin?SHF重組酵母表達載體的構建；S3：pPIC9K?CTS表達載體的轉化；S4：重組Pichia?pastoris的誘導表達。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫同毅，張大偉，王希輝，
申請(專利權)人：青島根源生物技術集團有限公司，
類型：發明
國別省市：
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