絲狀真菌宿主菌株和DNA構建體以及它們的使用方法技術

本發明專利技術涉及絲狀真菌宿主菌株和用于其產生和使用的重組DNA構建體。所述絲狀真菌宿主菌株特別可用于實現重組酶和變體的可靠表達。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】絲狀真菌宿主菌株和DNA構建體以及它們的使用方法相關專利申請的交叉引用本專利申請要求于2010年6月3日提交的美國臨時申請61/351,286的優先權，所述美國臨時申請的公開內容以引用方式并入本文。
本專利技術涉及絲狀真菌宿主菌株和用于其產生和使用的重組DNA構建體。絲狀真菌宿主菌株特別可用于以可靠或較不可變的方式表達目的蛋白質，且用于有效篩選編碼重組蛋白的DNA文庫。
技術介紹
絲狀真菌宿主細胞菌株已被工程改造為表達各種蛋白質。隨后，任選在純化后，這些蛋白質可以用于各種工業、學術或其他應用中。表達過程通常會是無法預測的。僅極少數(如果有的話)所制備的轉化體實際上產生目的酶，這并非罕見情況。異源基因(例如非天然基因，或以與天然形式不同的形式存在的天然基因)的表達的可變性可由于與其核酸和/或氨基酸序列無關的因素而出現。例如，非同源整合在絲狀真菌中占優勢。因此，表達載體隨機整合到基因組內，可能導致對轉化體間表達水平的位置效應。此外，可能生成不穩定轉化體，使得有必要對轉化體進行進一步篩選，以獲得穩定轉化體。可變性還可通過由于多核原生質體的轉化所導致的異核體的生成而出現。因此，以減低的可變性生產目的酶的可靠方法具有明確優點。對于某些工業應用，由真菌宿主菌株生產的這些蛋白質通常被工程改造的，以獲得新的期望特征或不同水平的某些特征。在這些情況下，通常使用現有絲狀真菌宿主細胞菌株來篩選編碼變體蛋白質的DNA文庫。表達效力和/或水平的可變性使得難以將給定變體的特征與另一變體的特征進行比較。因此，如果變體可以被可靠地表達(如果它們可以由特定宿主細胞表達的話)，并且如果變體可以以較不可變的水平表達而使得它們的特征可以更容易地評估和比較，則明確存在特定的優點。雖然端粒的、染色體外的復制載體可以用作基因組整合的替代物，但這種方法并不消除轉化體之間的表達水平的可變性。因此，若有手段來減少絲狀真菌宿主菌株基因表達中的序列依賴性差異，將給本領域帶來好處。
技術實現思路
本專利技術涉及絲狀真菌宿主菌株和用于其產生和使用的重組DNA構建體。絲狀真菌宿主菌株能可靠地產生轉化體且表達酶，其中表達水平的可變性減低。絲狀真菌宿主菌株可用于有效篩選編碼重組蛋白的DNA文庫。特別地，本專利技術提供絲狀真菌宿主細胞表達系統，其包含：a)真菌宿主細胞，所述真菌宿主細胞在其染色體DNA中含有非同源重組(NHR)途徑的一個或多個組分的破壞、缺乏第一可選擇功能的第一可選擇標記的部分、和可有效賦予第二可選擇功能的第二可選擇標記；和b)核酸分子，所述核酸分子含有當被引入該真菌宿主細胞中時給該第一可選擇標記賦予第一可選擇功能的序列、可有效表達一種或多種目的基因或變體目的基因的序列、和與側接染色體可選擇標記的序列具有實質同源性的序列；其中所述同源序列引起同源重組事件，所述同源重組事件導致有功能的第一可選擇標記、導致第二可選擇標記的去除和導致目的基因或變體目的基因的表達。在一些實施方案中，NHR途徑的一個或多個組分包括ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs2中的一者或多者。在某些實施方案中，在b)中引入真菌宿主細胞中的核酸分子可以是非天然的分子或者以對于真菌宿主細胞非天然的形式存在的天然分子。基因缺失可以通過使用缺失質粒來實現。例如，可以將待缺失或破壞的所需基因插入質粒中。然后在適當的限制性酶位點(在所需的基因編碼區的內部)切割該缺失質粒，并且用可選擇標記替換基因編碼序列或其部分。來自待缺失或破壞的基因的基因座的側翼DNA序列(優選在約0.5至2.0kb之間)保留在可選擇標記基因的任一側上。合適的缺失質粒將通常具有存在于其中的獨特限制性酶位點，以使得含有該缺失基因的片段(包括側翼DNA序列)和可選擇標記基因能夠作為單一線性小片被去除。缺失質粒還可以通過使用PCR擴增所需側翼區和可選擇標記來構建，在擴增的片段的末端具有限制性酶位點以促進片段的連接。作為另外一種選擇，可通過指定適當的側翼DNA和可選擇標記序列來從頭合成缺失質粒。在一些實施方案中，所述第一和第二可選擇標記是不同的標記。在一些實施方案中，所述第一和第二可選擇標記獨立地選自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博來霉素抗性標記、殺稻瘟素抗性標記、吡啶硫胺素抗性標記、氯嘧磺隆抗性標記、新霉素抗性標記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因和胸苷激酶。在一些實施方案中，所述同源序列中的至少一個在pyr2序列的上游或下游。在一些實施方案中，所述同源序列在pyr2序列的上游和下游。在其他實施方案中，所述同源序列包含可有效表達一種或多種目的基因或一種或多種變體目的基因的序列和對第一可選擇標記賦予第一可選擇功能的序列。在一些實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是選自木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、腐質霉屬(Humicola)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)和裸孢殼屬(Emericella)的屬中的種。在一些實施方案中，木霉是里氏木霉(T.reesei)，而在其他實施方案中，曲霉是黑曲霉(A.niger)。、本專利技術提供絲狀真菌宿主細胞表達系統，其中所述目的基因或變體目的基因選自半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質酶(cutinase)、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木質素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質酸酶、軟骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。目的基因或變體基因的非限制性例子編碼：涉及淀粉代謝的蛋白質或酶、涉及糖原代謝的蛋白質或酶、乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲基酯酶、果膠裂解酶(pectinolyticenzyme)、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇異果甜蛋白、轉移酶、轉運蛋白、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化還原酶，EC1.1.3.5)、其變體及其組合。在一些實施方案中，目的基因或變體目的基因編碼選自下述的多肽：肽激素、生長因子、凝血因子、趨化因子、細胞因子、淋巴因子、抗體、受體、粘附分子和微生物抗原(例如HBV表面抗原、HPVE7等)及其變體(例如片段)。此外，本專利技術提供在絲狀真菌宿主細胞中表達目的基因或變體目的基因的方法，所述方法包括：將對第一可選擇標記賦予第一可選擇功能的核酸分子引入絲狀真菌宿主細胞中，所述核酸分子可以是非天然或天然(但以非天然形式存在)分子；使宿主細胞生長；以及選擇具有第一可選擇功能但缺乏第二可選擇功能的宿主細胞。在一些實施方案本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.06.03 US 61/351,2861.一種絲狀真菌宿主細胞表達系統，包含：a.真菌宿主細胞，所述真菌宿主細胞在其染色體DNA中含有非同源重組(NHR)途徑的一個或多個組分中的破壞、缺乏第一可選擇功能的第一可選擇標記、和可有效賦予第二可選擇功能的第二可選擇標記；和b.核酸分子，所述核酸分子含有(1)當引入所述真菌宿主細胞中時給所述在宿主細胞染色體上的第一可選擇標記賦予所述第一可選擇功能的序列；(2)可有效表達一種或多種目的基因的序列；(3)和與側接所述可選擇標記的序列具有實質同源性的序列；其中所述同源序列引起同源重組事件，所述同源重組事件導致有功能的第一可選擇標記、導致所述第二可選擇標記的去除和導致所述目的基因的表達。2.根據權利要求1所述的絲狀真菌宿主細胞表達系統，其中所述NHR途徑的一個或多個組分選自ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs。3.根據權利要求1所述的絲狀真菌宿主細胞表達系統，其中所述第一可選擇標記和所述第二可選擇標記是選自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博來霉素抗性標記、殺稻瘟素抗性標記、吡啶硫胺素抗性標記、氯嘧磺隆抗性標記、新霉素抗性標記、腺嘌呤途徑基因、色氨酸途徑基因和胸苷激酶的不同標記。4.根據權利要求1所述的絲狀真菌宿主細胞表達系統，其中所述真菌宿主細胞來自選自木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、腐質霉屬(Humicola)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鏈孢霉屬(Neu...

【專利技術屬性】
技術研發人員：B·S·鮑爾，T·卡佩爾，B·R·凱萊門，
申請(專利權)人：丹尼斯科美國公司，
類型：
國別省市：