從蠟包埋樣品中提取核酸制造技術

本發明專利技術涉及從蠟包埋樣品中提取核酸的方法，特定溶劑在從交聯蠟包埋樣品中提取、分離和/或純化核酸的方法中從蠟包埋樣品脫蠟的用途，以及從蠟包埋樣品中提取、分離和/或純化核酸的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】從蠟包埋樣品中提取核酸本專利技術涉及從蠟包埋樣品中提取核酸的方法。特定溶劑在從交聯蠟包埋樣品中提取、分離和/或純化核酸的方法中用于從蠟包埋樣品中脫蠟的用途，以及用于從蠟包埋樣品中提取、分離和/或純化核酸的試劑盒。從活生物體中取出的生物材料如組織、組織碎片或分離細胞，若不使用常規方法，例如，孵育于營養介質，后者將于短期后死亡。已死亡的細胞還快速進行初始的自溶性發酵，然后是細菌降解，致使初始的“組織中的細胞”這一結構被破壞。因此，如果想對取出的生物樣品進行組織學檢查，那么有必要固定所述樣品以抑制其分解。采用固定的方式是為了將生物結構基本保存為生命樣形態，以使“真實評價”可行。固定的另一個優勢在于樣品可作為檔案長期保存這一事實。并且，許多形態學考察只可在已固定材料的基礎上進行。通常采用沉淀或交聯化合物如酸、醇、酮或醛來完成固定，尤其是甲醛(一般使用4 - IOwt. -%或35wt. -%的水溶液形式，兩者都稱為“福爾馬林”)，然后通常用蠟，常用石蠟(所謂“福爾馬林固定，石蠟包埋”，(FFPE)材料)包埋固定材料。使用包埋介質的主要目的是，使樣品可在自然狀態下進行切片和安放，以供顯微和/或組織學應用。然而，對于多數應用，例如在對樣品進行組織學染色之前，從樣品中脫去包埋介質是必要或至少是有益的。脫石蠟的常規方法包含使用芳香族溶劑如甲苯，特別是二甲苯。通常將新鮮切片或安放于顯微載片的樣品浸入二甲苯浴直至石蠟溶解。在后續步驟中，用醇濃度遞減的一系列醇溶液洗滌脫石蠟樣品以去除二甲苯，然后用水進行最后洗滌，使得樣品與水性的反應物/試劑溶液如裂解緩沖液或染色溶劑相容。可是，二甲苯是可燃、揮發性且有毒的有機溶劑。因此，在過去幾年中，為采用較低毒性的脫石蠟劑替換二甲苯，人們做了大量的努力。組織學應用中，替換二甲苯的例子包含萜油，如d-檸檬烯、異石蠟烴類或水性洗碟用皂液(R. J. Buesa, M. V. Peshov, Annals of Diagnostic Pathology 2009, 13, 246-256)。就脫蠟而言，這些脫石蠟劑中的一些與二甲苯水平相當，但毒性較低甚至無毒。然而，為了在用水洗滌以實現與多數類型的免疫組化染色相容之前去除溶劑/脫石蠟劑，很多情況仍需要進行一系列醇洗滌。隨著生物分子技術的發展，對于蠟包埋樣品尤其是FFPE樣品不單進行光學顯微檢察，還分析其中所得核酸(DNA和RNA)已日漸重要。對從此類樣品獲得的核酸可利用高度靈敏的技術如聚合酶鏈反應(PCR)進行后續分析。然而，如果作為免疫組化染色的替代或補充，考慮從蠟包埋樣品中提取核酸，那么，脫石蠟劑不干擾任何后續的核酸濃縮、純化、分離和/或分析步驟，或者該試劑可在樣品脫石蠟后被完全去除，是非常重要的。為了從FFPE樣品回收核酸，所述樣品通常使用二甲苯脫蠟，再用醇濃度遞減的醇溶液洗滌數次，隨后在適當的消化緩沖液裂解。在后續步驟中，常采用有機提取法如苯酚/氯仿提取來從這些緩沖液中提取核酸，并任選利用如乙醇或異丙醇來沉淀而進一步濃縮核酸。若使用包含如硫氰酸胍的離液消化緩沖液，或者在消化/裂解步驟后添加離液劑至樣品，所述核酸也可通過固相選擇性結合核酸的方式來分離，例如二氧化硅膜或玻璃珠，由此避免上述使用毒性溶劑的液/液提取步驟。另一方面，離液物質也被認為是有毒的。為盡量減少毒性物質用量以及洗滌步驟次數，已開發了若干市售可得的試劑盒用于分離核酸(包括DNA和RNA)，其中大多數采用二甲苯作為脫石蠟劑，盡管包含例如以職類作為脫石臘劑的試劑盒同樣可得(J. B. A. Okello AnalyticalBiochemistry2010,400(1)，110-117)。來自TG公司(TrimGen，美國馬里蘭州斯帕克斯)的市售無蠟石蠟樣品制備試劑盒中采用另一方法。使用專有溶液脫蠟后，在樣品中加入一種特殊樹脂和一種酶混合物。所述酶混合物消化樣品，而潛在的PCR抑制劑與所述樹脂結合，可在PCR擴增前容易地從樣品去除。雖然使用該試劑盒可在基于PCR擴增FFPE組織回收所得核酸中獲得良好結果，但是該方法可能并不適合其它后續分析步驟。另外，所述樹脂適應于消化混合物和脫蠟溶液中所存在的特定成分。因此，所述試劑盒不能與任意裂解緩沖液結合使用。所以，本專利技術所要解決的問題是提供從蠟包埋樣品中提取核酸的方法，該方法既不需要有毒脫石蠟劑，繁復的洗滌步驟，又不需要特別適應于捕獲樣品中污染物或PCR抑制劑的樹脂。所述目標由本專利技術所述方法實現。意外地發現，在仍含有蠟增溶劑和溶蠟的雙相或多相系統中，能實現已去石蠟的原蠟包埋樣品的裂解，且不影響裂解結果。因此，無需繁復的洗滌步驟和用以捕獲污染物的樹脂。因此，本專利技術提供從蠟包埋樣品中提取核酸的方法，所述方法包含如下步驟I.使樣品接觸蠟增溶劑，所述蠟增溶劑包含至少一種與水不混溶的有機溶劑，2.任選地孵育步驟I所得的混合物，3.向仍然含有蠟增溶劑的混合物中加入水性裂解緩沖液，4.孵育步驟3所得的混合物以得到雙相或多相混合物，其包含至少一個有機相和一個水相，所述有機相主要含有溶蠟和所述蠟增溶劑，所述水相含有核酸，其中如果省略步驟2，則步驟I和3也可作為一個合并步驟來進行。所述方法還可包含以下任選步驟5.將所述有機相與所述水相分離和/或6.從所述水相分離和/或純化核酸。在本專利技術中，術語“蠟包埋樣品”包含如用于組織化學或其它化學和/或生物分析的包埋于蠟的任何生物樣品。所述蠟通常由高級烴的復雜混合物組成，并可包含其他組分如高級脂肪酸和/或糖醇的酯類等。所述蠟可來源于自然和/或合成，并且可額外含有增強其樣品包埋性質的添加劑，例如DMSO或高級聚烯烴。所述蠟可優選代表石蠟，石蠟是主要由飽和烴組成的混合物，室溫下為固體，通常由石油蒸餾制備。無論所用的石蠟類型是所謂的高或低熔點石蠟或它們的混合物，所述樣品都可利用本專利技術所述的方法和/或試劑盒進行處理。任選地，例如為了改善蠟的特定性質，所述石蠟可含有本領域已知的添加劑，例如小量有機聚合物或DMS0。所述樣品可優選為福爾馬林固定石蠟包埋的樣品，其中生物樣品在石蠟包埋前已經甲醛固定。所述生物樣品可以是來源于人，動物或植物，或微生物(如細菌、病毒或真菌)的完整生物體，生物體的部分，特別是組織碎片或組織切片。也可使用分離自細胞培養物的包埋細胞。作為裂解緩沖液(步驟3)，可使用能裂解/破壞含細胞材料中細胞的任何水溶液，5由此將核酸釋放入溶液而不破壞待分離核酸。現有技術已知的許多水性消化緩沖液可用于本專利技術所述方法。若被包埋樣品是已固定樣品，例如福爾馬林固定樣品，所述消化緩沖液可含有現有技術已知的附加成分，來降低樣品中的交聯數量。然而，裂解液中并非必須含有所述附加成分，因為步驟4所述的孵育過程中，如果采用約90° C的孵育溫度，即使不含減少交聯數量的化合物，仍可有效去除交聯。由于這些裂解緩沖液通常以水溶液形式施用于樣品，裂解后獲得多相混合物，其中包含至少一個有機相和一個水相，所述有機相主要包含溶蠟和蠟增溶劑，所述水相中包含核酸(以及例如其它細胞成分)。在大多數情況中，所述多相混合物是恰好包含一個有機相和一個水相的雙相混合物。但舉例來說，裂解步驟可在還有固相存在時進行(前提是固相不適于捕獲樣品中PCR抑制化合物)，這種本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M·穆勒，T·辛格，E·羅森伯格，J·赫克倫布羅奇，
申請(專利權)人：恰根有限公司，
類型：
國別省市：