本發明專利技術公開了一種快速高效玉米線粒體DNA的提取及純化方法，將玉米外植體分裝至預冷的研缽中，按每克樣品4mL的比例加入預冷的提取緩沖液A，放入1-2g石英砂，研磨至勻漿；取3個10mL的離心管分別編號為A、B、C，再取3個2mL的離心管分別編號為D、E、F；在提取過程中，采用兩種RNA酶RNase?A和RNase?T1同時處理，可完全去除RNA的污染。MgCl2?具有DNaseI?buffer的作用，可替代DNaseI?buffer，降低成本。采用本發明專利技術的方法，mtDNA的產出率得到明顯提高。???
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及的是一種快速高效玉米線粒體DNA的提取及純化方法。
技術介紹
植物mtDNA提取方法，主要有密度梯度離心、差速離心等方法；密度梯度離心得到的線粒體DNA雖純度高，但操作復雜、耗時，而且對材料的需求量大，同時mtDNA產率低， 且長時間高速離心對離心機亦要求很高；利用密度梯度離心法提取線粒體DNA實驗結果如圖I所示，其主帶不清晰，條帶彌散，污染嚴重，而且過程繁瑣、耗時長；普通的差速離心雖然操作簡單，但所提取的mtDNA純度低、易降解，以及核DNA、RNA和蛋白質等雜質污染嚴重，不能滿足后續研究工作的需要；高鹽-蛋白酶K法提取線粒體DNA具有操作簡單，所提取的mtDNA具有結構完整、純度和產率較高等優點，能滿足PCR分析、基因定位、克隆等分子操作的需要。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種快速高效玉米線粒體DNA的提取及純化方法。本專利技術的技術方案如下一種快速高效玉米線粒體DNA的提取及純化方法，包括以下步驟(I)將玉米外植體分裝至預冷的研缽中，按每克樣4mL的比例加入預冷的提取緩沖液A，放入l_2g石英砂，研磨至勻漿；取3個IOmL的離心管分別編號為A、B、C，再取3個 2mL的離心管分別編號為D、E、F。(2)用6層無菌紗布過濾勻漿液，將磨碎組織放回研缽中，按每克樣2mL補加緩沖液A重新研磨并過濾,2次濾液合并。將濾液分裝到A管中，500r/min離心IOmin,去除大片碎片組織；(3)將上清液轉移至B管中，2600r/min離心2次，分別為15和lOmin，去除葉綠體等質體；(4)取上清液至C管中，10000 r/min離心15 min,棄上清,在沉淀中加入I mL 預冷的A液,用槍頭輕輕吹起沉淀,混勻。1000r/min離心IOmin,將上清吸入D管中，加入 1/500倍體積的100mg/mL DNaseI和1/100倍體積的lmol/L MgCl20冰浴Ih后加入1/25 倍體積的0. 5mol/L Na2EDTA,靜置10 min，終止DNaseI反應；(5) 13200r/min離心15min,去上清,得到線粒體沉淀,再加ST液純化I次,得到純化的線粒體；(6) D管沉淀中加ImL裂解液B懸浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2·5μ ，50τ 溫育I h，37°C再溫育lh，期間間隔搖動；(7)取出離心管室溫放置，待其冷卻后，加入等體積的苯酚氯仿異戊醇混合液，混合液混合體積比例為25 :24 :1，充分混勻，放在搖床上搖動15min，10000 r/min離心10 min ；(8)轉上清液至E管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混合液混合體積比例為24 :1，上下顛倒搖勻約IOmin, 10000 r/min離心10 min ；(9)將上清液轉移至F管中，然后加入1/100體積10mg/mL的RNaseA和1/500體積的 1000U/ μ L 的 RNaseT1JTt^KS I 小時，去掉 RNA ；(10)加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混合液混合體積比例24 :1，上下顛倒搖勻約 IOmin, 10000 r/min 離心 10 min ；(11)取上清液至I. 5mL的離心管中加入預冷的O. I倍體積NaAc和2倍體積無水乙醇，-20°C過夜；(12) 4°C、13200r/min離心15min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2 3次；(13)沉淀于空氣中干燥后溶入少量水中，-20°C冷藏備用。其中所用的試劑(I)緩沖液 A:lmol/L Tris-HCl 12. 5mL、0. 5mol/L Na2EDTA 12.5mL、1.3 mol/ L NaC l 15. 743g，用滅菌雙蒸水定容至250mL，高溫高壓滅菌，室溫保存。使用前添加O. 5g 85八、0.1258半胱氨酸、75(^1^ β-巰基乙醇。(2) ST 液蔗糖 13. 6916g，lmol/L Tris-HCl 5mL，O. 5mol/L Na2EDTA 5mL，用滅菌雙蒸水定容至lOOmL，高溫高壓滅菌，室溫保存。使用前添加0. Ig BSA。(3)裂解液 B: lmol/L Tris-HCl 2. 5mL,0. 5mol/L Na2EDTA 4mL, 10% SDS 5mL，用滅菌雙蒸水定容至IOOmL，室溫保存。本專利技術的有益效果(I)本實驗在提取過程中，采用兩種RNA酶RNase A和RNase T1同時處理，可完全去除RNA的污染。(2) MgCl2 具有 DNaseI buffer 的作用，可替代 DNaseI buffer,降低成本。(3) mtDNA的產出率得到明顯提高。附圖說明圖I為利用密度梯度離心法提取線粒體DNA實驗結果；圖2為采用本專利技術的方法提取線粒體DNA實驗結果；具體實施方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。(I)將玉米外植體分裝至預冷的研缽中，按每克樣4mL的比例加入預冷的提取緩沖液A，放入l_2g石英砂，研磨至勻漿；取3個IOmL的離心管分別編號為A、B、C，再取3個 2mL的離心管分別編號為D、E、F。(2)用6層無菌紗布過濾勻漿液，將磨碎組織放回研缽中，按每克樣2mL補加緩沖液A重新研磨并過濾,2次濾液合并。將濾液分裝到A管中，500r/min離心IOmin,去除大片碎片組織；(3)將上清液轉移至B管中，2600r/min離心2次，分別為15和lOmin，去除葉綠體等質體；(4)取上清液至C管中，10000 r/min離心15 min,棄上清,在沉淀中加入I mL 預冷的A液,用槍頭輕輕吹起沉淀,混勻。1000r/min離心IOmin,將上清吸入D管中，加入 1/500倍體積的100mg/mL DNaseI和1/100倍體積的lmol/L MgCl20冰浴Ih后加入1/25 倍體積的0. 5mol/L Na2EDTA,靜置10 min，終止DNaseI反應；(5) 13200r/min離心15min,去上清,得到線粒體沉淀,再加ST液純化I次,得到純化的線粒體；(6) D管沉淀中加ImL裂解液B懸浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K 2. 5 μ L, 50°C 溫育I h，37°C再溫育lh，期間間隔搖動；(7)取出離心管室溫放置，待其冷卻后，加入等體積的苯酚氯仿異戊醇混合液，混合液混合體積比例為25 24 :1，充分混勻，放在搖床上搖動15min，10000 r/min離心 10 min ；(8)轉上清液至E管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混合液混合體積比例為24 :1，上下顛倒搖勻約IOmin, 10000 r/min離心10 min ；(9)將上清液轉移至F管中，然后加入1/100體積10mg/mL的RNaseA和1/500體積的1000U/ μ L的RNaseTJTt水浴I小時，去掉RNA ；(10)加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混合液混合體積比例24 :1，上下顛倒搖勻約 IOmin, 10000 r/min 離心 10 min ；(11)取上清液至I. 5mL的離心管中加入預冷的0. I倍體積NaAc和2倍體積無水乙醇，-20°C過夜；(12) 4°C、13200r/min離心15min，棄上清，沉淀用75%本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種快速高效玉米線粒體DNA的提取及純化方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)？將玉米外植體分裝至預冷的研缽中，按每克樣4mL的比例加入預冷的提取緩沖液A，放入1？2g石英砂，研磨至勻漿；取3個10mL的離心管分別編號為A、B、C，再取3個2mL的離心管分別編號為D、E、F；(2)用6層無菌紗布過濾勻漿液，將磨碎組織放回研缽中，按每克樣2mL補加緩沖液A？重新研磨并過濾，2次濾液合并；將濾液分裝到A管中，500r/min離心10min，去除大片碎片組織；(3)？將上清液轉移至B管中，2600r/min離心2次，分別為15和10min，去除葉綠體等質體；(4)？取上清液至C管中，10000？r/min離心15？min，棄上清，在沉淀中加入1？mL預冷的A液，用槍頭輕輕吹起沉淀，混勻；1000r/min離心10min，將上清吸入D管中，加入1/500倍體積的100mg/mL？DNaseI？和1/100倍體積的1mol/L？MgCl2；冰浴1h后加入1/25倍體積的0.5mol/L？Na2EDTA，靜置10？min，終止DNaseI反應；(5)？13200r/min離心15min，去上清，得到線粒體沉淀，再加ST液純化1次，得到純化的線粒體；(6)？D管沉淀中加1mL裂解液B懸浮沉淀，再加入25mg/mL蛋白酶K？2.5μL，50℃溫育1？h，37℃再溫育1h，期間間隔搖動；(7)？取出離心管室溫放置，待其冷卻后，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇混合液，混合液混合體積比例為25：24：1，充分混勻，放在搖床上搖動15min，10000？r/min離心10？min；(8)？轉上清液至E管中，加入等體積的氯仿：異戊醇混合液，混合液混合體積比例為24：1，上下顛倒搖勻約10min，10000？r/min離心10？min；(9)？將上清液轉移至F管中，然后加入1/100體積10mg/mL的？RNaseA和1/500體積的1000U/μL的RNaseT137℃水浴1小時，去掉RNA；(10)？加入等體積的氯仿：異戊醇混合液，混合液混合體積比例24：1，上 下顛倒搖勻約10min，10000？r/min離心10？min；(11)？取上清液至1.5mL的離心管中加入預冷的0.？1倍體積NaAc和2倍體積無水乙醇，？20℃過夜；(12)？4℃、13200r/min離心15min，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2~3次；(13)？沉淀于空氣中干燥后溶入少量水中，？20℃冷藏備用；其中所用的試劑：(1)？緩沖液A：1mol/L？Tris？HCl？12.5mL、0.5mol/L？Na2EDTA？12.5mL、1.3？mol/L？NaCl？15.743g，用滅菌雙蒸水定容至250mL，高溫高壓滅菌，室溫保存；使用前添加0.5g？BSA、0.125g半胱氨酸、750μL？β？巰基乙醇；(2)？ST液：蔗糖13.6916g，1mol/L？Tris？HCl？5mL，0.5mol/L？Na2EDTA？5mL，用滅菌雙蒸水定容至100mL，高溫高壓滅菌，室溫保存；使用前添加0.1g？BSA；？(3)裂解液B：1mol/L？Tris？HCl？2.5mL，0.5mol/L？Na2EDTA？4mL，10%？SDS？5mL，用滅菌雙蒸水定容至100mL，室溫保存。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹墨菊，榮廷昭，張艷花，張晨，汪靜，盧艷麗，謝程程，張采波，徐浩，徐東平，黃俊，汪宏維，蘭海，唐祈林，吳元奇，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：
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