本發明專利技術公開了一種同時提取和純化RNA和DNA的試劑盒及方法。本發明專利技術所述的試劑盒包括共提取裂解液、2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、70%或75%DEPC酒精、滅菌DEPC水、反提萃取液和核酸純化柱。本發明專利技術的優點是：建立了同時提取RNA和DNA的提取方法并組裝了試劑盒。該方法與經典的單獨提取RNA或者DNA單獨提取的方法相比較，提取效率相當，同時在方法中還提供了RNA和DNA進一步純化的方法。其優勢在于能夠同時提取并純化RNA和DNA，使用者可以根據實際的檢測需要，選取不同的方法進行核酸提取。此外，本發明專利技術也為同時檢測兩種不同類型核酸的檢測技術提供了很好的基礎平臺。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種同時提取和純化RNA和DNA的試劑盒及方法，屬于檢驗檢疫領域。
技術介紹
在動物檢疫中，根據檢疫條款，一種樣品往往需要針對多種疫病開展檢測。隨著多重PCR和基因芯片等高通量檢測方法的廣泛應用，可以實現一次試驗完成多種針對檢疫條款的檢疫性疫病。而核酸(DNA和RNA)的提取與純化是這些技術應用的基礎與前提。核酸提取與純化主要分為以下幾種方法I.酚氯仿抽提法。該方法是核酸分離純化技術中最經典的方法之一，是由冷泉港實驗室中的研究人員首先提取的，并被大量的科研究工作者進行改良使用。其原理是在酚氯仿的共同作用下，蛋白質會被變性，形成不溶解的物質。由于蛋白質的密度小于酚而大于7K，所以離心后，會在酚相和水相于之間，形成蛋白質中間層，從而有效地將蛋白質和核酸分離開來。2.鹽析法。該技術原理是在組織或細胞裂解液中，加入高濃度鹽(NaCl或NH4Cl,KI, KAC)來沉淀去除蛋白質，從而得到高純度的基因組DNA。3.玻璃珠法。在高離液鹽(鹽酸胍，異硫氰酸胍，NaI)條件下，玻璃珠會同核酸發生吸附反應，而在低鹽條件下，核酸又可以被洗脫下來。但是玻璃珠的殘留以及干燥問題影響了這一技術的運用。至目前為止，大部分的公司已經去除這個純化技術。4.硅膠柱法。硅膠柱將核酸抽提或純化變成一種簡單的過濾操作，以取代傳統溶液型抽提技術的離心方式。硅膠柱的純化原理就是使用一種特殊的玻璃纖維濾膜，這種濾膜在高離液劑(鹽酸胍，NaI1NaClO4)的條件下，可以同核酸發生吸附反應，而在低鹽條件下，核酸又可以從濾膜中釋放出來，蛋白質和其它雜質不會被吸附，從而達到純化核酸的目的。硅膠柱的過濾吸附操作大大減少了抽提過程中離心和干燥時間，并去除耗時的醇類沉淀過程。5.磁珠法。磁珠法核酸純化技術采用了納米級磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標記了一種官能團，能同核酸發生吸附反應。娃磁(Magnetic Silica Particle)就是指磁珠微珠表面包裹一層娃材料，來吸附核酸，其純化原理類型于玻璃奶的純化方式。離心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一層可發生離心交換的材料(如DEAE，C00H)等，從而達到吸附核酸目的。不同性質的磁珠微珠所對應的純化原理是不一致。本專利技術根據實際需要，建立了同時提取動物細菌與病毒的RNA和DNA的提取方法并組裝了試劑盒。該方法與經典的單獨提取RNA或者DNA單獨提取的方法相比較，提取效率相當，同時在方法中還提供了對動物細菌和病毒的RNA和DNA進一步純化的方法。其優勢在于能夠同時提取并純化動物細菌和病毒的RNA和DNA，使用者可以根據實際的檢測需要，選取不同的方法進行核酸提取。此外，本專利技術也為同時檢測兩種不同類型核酸的檢測技術提供了很好的基礎平臺。
技術實現思路
本專利技術要解決的第一個技術問題是提供一種同時提取和純化動物細菌與病毒的RNA和DNA的試劑盒。本專利技術要解決的第二個技術問題是提供一種同時提取和純化動物細菌與病毒的RNA和DNA的方法。為解決第一個技術問題，本專利技術采用以下技術方案一種同時提取和純化RNA和DNA的試劑盒，其包括共提取裂解液、2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、70%或75%DEPC酒精、滅菌DEPC水、反提萃取液和核酸純化柱。其中，所述共提取裂解液包含4. 5mol/L異硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸鈉，體積分數7 X 10_6% β -巰基乙醇、3g/L消泡劑-A、0. 05mol/L乙二胺四乙酸;其pH值為8. O。進一步地，所述氯仿/異戊醇混合液中氯仿與異戊醇的體積比為24: I。進一步地，所述反提萃取液包含4mol/L異硫氰酸胍、O. 05mol/L檸檬酸鈉、Imol/LTris ;其？!1 值為 8.0。進一步地，所述核酸純化柱優選為硅膠膜離心吸附柱。為解決第二個技術問題，本專利技術采用以下技術方案利用上述試劑盒的同時提取和純化RNA和DNA的方法，包括如下步驟( I)利用共提取裂解液對樣品進行裂解得到裂解物； ( 2 )將裂解物輕微振蕩，加入2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液，置冰上放置 IOmin ；(3)離心，得到上層液相及下層液相；(4)吸取步驟(3)中離心得到的上層液相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，獲得混合液體A,然后進行RNA提取與純化；進一步地，如果對RNA的純度要求不高，可按照常規操作提取與純化RNA，具體方法為將混合液體A離心，棄上清，用70%或75%DEPC酒精洗滌，干燥后加入滅菌DEPC水溶解，即得。如果為了達到更高的純度要求，所述RNA提取與純化的具體方法為將混合液體A利用核酸純化柱提取與純化，得到高純度的RNA。( 5 )吸取步驟(3 )中離心得到的下層液相，加入反提萃取液，顛倒混勻，靜置，離心，吸取上層液相再加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，靜置，獲得混合液體B，然后進行DNA提取與純化。進一步地，如果對DNA的純度要求不高，所述DNA提取與純化的具體方法為將混合液體B離心，棄上清，用70%或75%DEPC酒精洗滌，干燥后加入滅菌DEPC水溶解，即得。如果為了達到更高的純度要求，所述DNA提取與純化的具體方法為將混合液體B利用核酸純化柱提取與純化，得到高純度的DNA。本專利技術的優點是建立了同時提取RNA和DNA的提取方法并組裝了試劑盒。該方法與經典的RNA或者DNA單獨提取的方法相比較，提取效率相當，同時在方法中還提供了對RNA和DNA進一步純化的方法。其優勢在于能夠同時提取并純化RNA和DNA，使用者可以根據實際的檢測需要，選取不同的方法進行核酸提取或純化。此外，本專利技術也為同時檢測兩種不同類型核酸的檢測技術提供了很好的基礎平臺。下面結合說明書附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步說明，凡依照本專利技術公開內容所做的任何本領域的等同替換，均屬于本專利技術的保護范圍。附圖說明圖I為應用提取的核酸樣品進行口蹄疫病毒RT-PCR檢測和豬鏈球菌2型PCR檢測結果，其中MMarker DL2000 ；I =Trizol法提取RNA，口蹄疫RT-PCR檢測結果；2 :實施例4的試劑盒提取核酸，口蹄疫RT-PCR檢測結果；3 :煮沸法提取DNA，豬鏈球菌2型PCR檢測結果；4 :實施例4的試劑盒提取核酸，豬鏈球菌2型PCR檢測結果。具體實施例方式本專利技術所用滅活的口蹄疫病毒為北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心保存，滅活的豬鏈球菌由中國獸醫藥品監察所提供。實施例I :混合樣品的制備為了驗證本專利技術試劑盒的提取效果，選擇本實驗室保存的已滅活的口蹄疫病毒和豬鏈球菌作為參試材料，制備了含有動物細菌和病毒的混合樣品。亞洲I型口蹄疫病毒(毒株編號為As-l/PK-l/2005)細胞培養物。滅活前病毒的濃度為:109TCID50/mL。滅活豬鏈球菌2型(中國獸醫藥品監察所饋贈)菌懸液，滅活前菌懸液的濃度為108CFU/mL。具體制備過程如下(I)在二級生物安全柜內，用滅菌的I3BS(pH7. 2)將上述兩種參試菌/毒株的濃縮懸液分別稀釋至105TCID5Q/mL和105CFU/mL。(2)將兩種稀釋后的懸液分別取5mL，充分混合均勻，分裝至I. 5mL滅菌離心管中，制成混合樣品，-80 V保存備用。實施例2 =Trizol法單獨提取混合樣品的RNA用Trizol法提取實例I中混本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種同時提取和純化RNA和DNA的試劑盒，其特征在于，包括共提取裂解液、2M醋酸鈉、水飽和酚、氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、70%或75%DEPC酒精、滅菌DEPC水、反提萃取液和核酸純化柱，其中，所述共提取裂解液包含：4.5mol/L異硫氰酸胍，2g/L十二烷基肌酸鈉，體積分數7×10？6%β？巰基乙醇、3g/L消泡劑？A、0.05mol/L乙二胺四乙酸，pH值為8.0。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張偉，蒲靜，高志強，凌鳳俊，汪琳，谷強，喬彩霞，尹義，張利峰，張鶴曉，
申請(專利權)人：中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局，
類型：發明
國別省市：
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