本發明專利技術首先提供一種腸道病毒RNA提取試劑盒，它包含如下組分，①RNA提取溶液Ⅰ：含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和100~400μg/ml的磁珠；②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化鈉；和④RNA提取溶液Ⅳ：硅油。本發明專利技術提供的提取試劑盒能配合自動化儀器使用，進行腸道病毒RNA定量檢測；該試劑盒RNA提取得率高、檢測靈敏度高；能對各樣本中的RNA濃度進行快速、準確測定，為早期診斷各類病原體感染提供可靠的實驗依據。本發明專利技術還提供一種包含RNA洗脫液的磁珠法RNA提取試劑盒和一種一步法提取RNA的試劑盒。本發明專利技術提供的三種試劑盒都能有效提取含有各種抑制物的肛拭子、糞便、咽拭子等不同類型樣本的腸道病毒RNA。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術提供一種腸道病毒(Enterovirus, EV) RNA提取試劑盒,具體是ー種磁珠法提取RNA的試劑盒，本專利技術還提供相應提取純化腸道病毒RNA的方法。
技術介紹
目前，國內已有多種基于實時熒光定量PCR技術定量檢測RNA的試劑盒應用于臨床檢測中，這些試劑盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。該類試劑盒具有一定的優點，但存在很多不足之處1)檢測靈敏度低，約在50(Tl000COpies/ml左右；檢測線性檢測范圍窄，一般在I. 00E+03copies/m廣I. 00E+07copies/ml之間，對于臨床高值 (大于5. 00E+07copies/ml)和低值(小于I. 00E+03copies/ml)的樣本無法檢測；2)酚-氯仿法是最經典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對于設備和人員操作要求高，低病毒載量的標本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時長，特異性較差；3)現有試劑無法與自動化儀器配套使用，大大增加了檢測成本；4)國外性能優異的試劑有QAGEN、PR0MEGA和OMEGA等公司產品，但試劑成本和耗材成本太高，很難在臨床廣泛開展。磁珠(免疫磁珠)法是近年發展迅速且被廣泛應用的ー種核酸提取方法，其系列試劑不含氯仿、苯酚等毒性大的有機溶劑；提取純化的核酸質量好、產量高；提取步驟更簡單，不需要離心，易于實現自動化；該技術中核酸可以從磁珠上洗脫下來進行后續檢測和作其他用途；如需要對核酸進行準確定量，則核酸也可不與磁珠分離便進行后續檢測。這些優點使其有替代其它核酸提取和純化方法的發展趨勢。然而目前磁珠法所用核酸提取試劑基本上為國外開發和壟斷，價格非常昂貴，從而限制了其在我國的廣泛應用。
技術實現思路
因此，本專利技術的目地在于開發一種磁珠法提取腸道病毒RNA的試劑盒，該試劑盒中的試劑易于獲取，有利于磁珠法用于RNA提取的大范圍推廣。本專利技術首先提供一種腸道病毒RNA的提取試劑盒，它包含如下組分，①RNA提取溶液I :包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和磁珠，且所述十二烷基硫酸鈉可以以SDS、LLS、Chelex-100, Tween 20和NP-40中的任意一種或多種替代！②RNA提取溶液II 含4-羥こ基哌嗪こ磺酸和氯化鈉RNA提取溶液III :含曲拉通和氯化鈉，且所述氯化鈉可以以氯化鉀或氯化鋰替代；和④RNA提取溶液IV :硅油。本專利技術提供的上述提取試劑盒能配合自動化儀器(如熒光定量PCR擴增儀)使用，進行腸道病毒RNA的定量檢測；該試劑盒RNA提取得率高、檢測靈敏度高；能對肛拭子、糞便、和咽拭子等樣本中的病原體RNA濃度進行快速、準確測定，為早期診斷各類病原體感染提供可靠的實驗依據。在本專利技術的試劑盒中，針對腸道病毒RNA的提取，使用了 RNA提取溶液IV :硅油；該組分的使用能使得RNA病毒樣本中的雜質得到更好的去除。另外，本專利技術的試劑盒為專門針對RNA的提取試劑盒，其中的磁珠置于RNA提取溶液I中能取得更好的提取效果；而在磁珠法用于DNA提取時，磁珠均置于RNA提取溶液II中以取得更好的提取效果。本專利技術還提供一種腸道病毒RNA提取試劑盒，它包含上述試劑盒中的組分① ④，還包括RNA洗脫液，所述RNA洗脫液包含Tris-HCl和EDTA。在該RNA提取試劑盒中，增加的組分RNA洗脫液可使得RNA從磁珠上洗脫，一方面有利于待測樣本RNA的定性檢測(如上機進行熒光PCR檢測)，另ー方面從磁珠上洗脫下來的純化RNA可作其它用途。本專利技術還提供另ー種RNA提取試劑盒，該試劑盒中還包括用于快速提取腸道病毒RNA的核酸釋放劑水溶液,所述核酸釋放劑包括莎梵婦(sur factin) O. OfO. 2mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉O. 05 30g/L，和こ醇O. Γ % (ν/ν)。使用該核酸釋放劑可對RNA進行一歩法快速提取，使用該核酸釋放劑時可不用上述RNA提取溶液I IV，而僅使用該核酸釋放劑來滿足某些病毒RNA的快速提取；該核酸釋放劑相應的器材簡單，操作簡便，提取過程耗時短，成本低。當本專利技術的RNA提取試劑盒中既包括RNA提取溶液I IV、又包括該核酸釋放劑，還選擇性地包括RNA洗脫液時，基本上能滿足在RNA核酸提取過程中不同的需求，且都能實現自動化。在本專利技術試劑盒用于EV RNA的檢測吋，使用磁珠法相應的RNA提取溶液或使用ー步法相應的核酸釋放劑均能準確快速地提取EV RNA ;但在實際應用中，若只需檢測EV中的具體某種病毒,如腸道病毒71型(Human enterovirus 71, EV71)或柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16),則使用一步法相應的核酸釋放劑能有更快的核酸釋放速度；而若需分別同時檢測EV中的多種病毒，則使用磁珠法相應的RNA提取溶液會更加方便快捷。另外，該試劑盒中磁珠法相應的RNA提取溶液提取核酸的靈敏度會略高于ー步法相應的核酸釋放劑提取核酸的靈敏度，因而也可以從這個角度去選擇具體的RNA提取方法。本專利技術提供一種腸道病毒RNA檢測試劑盒，它包括上述任意ー種RNA提取試劑盒中的組分，還包括PCR反應液、酶混合液、陽性對照和陰性對照；所述PCR反應液中包括5XPCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、和用于靶多核苷酸擴增和檢測的引物和探針，所述酶混合液中包含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶，所述陽性對照為標定已知濃度的慢病毒，所述陰性對照為滅菌生理鹽水。根據本專利技術所述的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中還優選包括內標即陽性內對照，此時所述PCR反應液中還包含用于內標擴增和檢測的引物和探針。ー種如上所述試劑盒(磁珠法，RNA不洗脫)的提取純化腸道病毒RNA的方法，包括如下步驟步驟A，裂解病毒每支離心管加入含磁珠的RNA提取溶液I和待測樣本，混勻后離心；步驟B，磁珠吸附核酸每管加入RNA提取溶液II，混勻后靜置；步驟C，去除雜質經離心后將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，再緩慢將溶液吸出；步驟D，洗滌每管加入RNA提取溶液III和RNA提取溶液IV，混勻后離心，將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，靜置分層后將液體吸出丟棄。ー種如上所述試劑盒(磁珠法，RNA洗脫)的提取純化腸道病毒RNA的方法，它包括上述的步驟Al，還包括步驟D后的步驟E，即RNA洗脫加入所述RNA洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，混勻并靜置后將離心管再次置于磁珠分離器上，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中。具體實施例方式通過以下實施例來具體說明本專利技術，但本專利技術并不僅限于這些實施例。實施例I本實施例為磁珠法提取純化試劑盒(核酸不洗脫)用于提取純化腸道病毒RNA，結合熒光PCR擴增儀進行腸道病毒RNA的檢測。本實施例中的核酸提取試劑包括①RNA提取溶液I :由十二烷基硫酸鈉O. 6 (質量/體積)％、曲拉通3. 5 (v/v)%,異硫氰酸胍O. 8mol/L和300 μ g/ml的磁珠組成；·②RNA提取溶液II :包括4-羥こ基哌嗪こ磺酸100mmol/L、氯化鈉200mmol/L，溶液II的pH值為6·5±0·2 ;·③RNA提取溶液III 曲拉通O. 5 (ν/ν) 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于腸道病毒RNA的提取試劑盒，它包含如下組分，①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和磁珠，且所述十二烷基硫酸鈉可以以SDS、LLS、Chelex？100、Tween？20和NP？40中的任意一種或多種替代；②RNA提取溶液Ⅱ：含4？羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化鈉，且所述氯化鈉可以以氯化鉀或氯化鋰替代；④RNA提取溶液Ⅳ：硅油。
【技術特征摘要】
1.ー種用于腸道病毒RNA的提取試劑盒，它包含如下組分， ①RNA提取溶液I:包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和磁珠，且所述十二烷基硫酸鈉可以以SDS、LLS、Chelex-100, Tween 20和NP-40中的任意一種或多種替代； ②RNA提取溶液II:含4-羥こ基哌嗪こ磺酸和氯化鈉； ③RNA提取溶液III:含曲拉通和氯化鈉，且所述氯化鈉可以以氯化鉀或氯化鋰替代； ④RNA提取溶液IV:硅油。2.根據權利要求I所述的提取試劑盒，其特征在于，它包含如下組分， ①RNA提取溶液I:由十二烷基硫酸鈉O. 2^1. 0% (質量/體積)、曲拉通I. (Γ4. 0% (體積/體積)，異硫氰酸胍O. 2l. Omol/L和10(Γ400 μ g/ml的磁珠組成； ②RNA提取溶液II:包括4-羥こ基哌嗪こ磺酸10(T300mmol/L、氯化鈉10(T300mmol/し溶液II的pH值為6·5±0·2; ③RNA提取溶液III:含曲拉通O. Γ1. 0% (體積/體積)和氯化鈉10(T300mmol/L ； ④RNA提取溶液IV:硅油。3.根據權利要求I或2所述的提取試劑盒，其特征在干，該試劑盒中還包括RNA洗脫液，所述RNA洗脫液包含Tris-HCl和EDTA。4.根據權利要求I至3中任意一項所述的提取試劑盒，其特征在干，該試劑盒中還包括用于快速提取RNA的核酸釋放劑水溶液,所述核酸釋放劑包括莎梵婦(surfactin)O.OI O. 2mM/L，氯化鉀 2(T30...
【專利技術屬性】
技術研發人員：戴立忠，
申請(專利權)人：戴立忠，
類型：發明
國別省市：
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