改進的從磁性玻璃顆粒中的核酸回收制造技術

本發明專利技術是一種使用能夠結合核酸的固相，例如磁性玻璃顆粒分離核酸的方法，其中通過乙烯胺化合物的存在增強核酸與固相的結合。本發明專利技術還包括用于分離核酸的包含乙烯胺化合物的反應混合物和用于實施所述方法的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】改進的從磁性玻璃顆粒中的核酸回收專利
本專利技術涉及分離核酸的領域，和具體地使用固體支持物分離核酸的領域。技術背景分離核酸是分子診斷學中的重要步驟。從樣品中分離的核酸的質量和數量大大影響了下游診斷應用的成功。臨床和野外應用也要求分離程序迅速且能夠自動化。存在很多程序用于從多種生物和組織中分離核酸。一些類型的臨床和環境樣品對核酸的成功分離提出了特別的挑戰。例如，某些組織例如骨含有在可以評估核酸以前需要去除的大量細胞外材料。一些生物，例如真菌、植物和細菌具有需要劇烈化學處理的細胞壁或外膜。在劇烈處理中使用的試劑對利用分離的核酸的下游應用造成挑戰。此外，在劇烈處理期間的靶核酸的降解可導致下游檢測測定中的假陰性結果。但是為了臨床上可接受的，診斷程序必須具有足夠的靈敏度，即避免在患者樣品中的假陰性結果。因此在分子診斷學領域中，需要改進分離核酸的方法，從而使診斷程序靈敏、可信和易于操作。成功的基于核酸的診斷試驗的先決條件是分離沒有降解的、無抑制劑的核酸。同時，需要簡單、易于自動化的核酸分離程序。最近開始流行使用固體支持物，例如球形微粒分離核酸。特別流行的是含有或覆蓋玻璃樣物質的磁性微粒，通常被稱為“磁性玻璃顆粒”或“MGP”。使用MGP的核酸分離程序需要相對少的步驟和易于自動化。特別流行的是通過在歐洲公開EP I 154 443或美國專利6，255，477和6，870，047中描述的溶膠-凝膠法(sol-gel)制備的 MGP。通過溶膠-凝膠法制備的MGP的一般描述和具體實例可在文獻中容易地獲得(見例如EP I 154 443)。這些MGP由覆蓋基于二氧化硅的玻璃樣材料的鐵磁核心組成。鐵磁核心一般包含鐵氧化物，例如Fe3O4或Fe203。核心可為簡單的鐵核心，或可由復合材料組成。核心也可由結晶的、陶瓷或玻璃樣結構組成，其中包埋氧化鐵。玻璃涂層可由含氧化硅的無定形材料組成，并可還包含一種或多種另外的金屬氧化物例如氧化硼(B2O3)，氧化招(Al2O3),氧化韓(CaO),氧化鋇(BaO),氧化鉀(K2O),氧化鈉(Na2O),氧化酶(MgO)或氧化鉛(Pb2O3)。在一些實施方案中，玻璃是硅氧化物并也包含在以下濃度范圍中的一種或多種化合物=B2O3 (0-30%)，Al2O3 (0-20%)，CaO (0-20%)，BaO (0-10%)，K2O (0-20%)，Na2O(0-20%)，MgO (0-18%) ,Pb2O3 (0-15%)。玻璃可也包含小百分比(0_5%)的若干其他氧化物例如Mn2O3, TiO2, As2O3, Fe2O3, CuO和CoO。 已證明，由硼硅玻璃組合物組成的表面特別有效。硼硅玻璃具有超過25%的氧化硼含量，例如70/30的Si02/B203組成。有時候用便于核酸結合的官能團修飾磁性顆粒。這樣的基團包括(不限于)用于捕獲含多聚A的核酸的多聚T寡核苷酸，用于捕獲生物素標記的核酸的鏈霉抗生物素，和用于捕獲包含與探針互補的唯一序列的核酸的特定探針序列。但是，最常用的是具有未修飾表面的磁性顆粒，其能夠分離在樣品中存在的任意核酸，不管其序列。使用MGP的一般的核酸分離方案從破壞細胞或組織以釋放核酸開始。通常使用的組織破壞程序是化學、酶或物理性質的，包括超聲、高壓、剪切力、強堿、去垢劑或離液劑、蛋白酶或脂酶。用于化學和酶裂解，裂解試劑一般包括緩沖劑、鹽、一種或多種變性物質和離液物質、蛋白酶和任選地核酸酶抑制劑和防腐劑。裂解試劑導致蛋白質的降解，核酸酶的抑制和脂、脂蛋白等的增溶。例如，緩沖劑可為Tris，鹽可為鈉、鉀、銨或鎂鹽，例如氯化物或醋酸鹽，去垢劑可為十二烷基硫酸鈉、Triton-X或Tween，離液劑可為尿素、硫脲、亞碘酸鈉、十二烷基硫酸鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或亞氯酸胍，核酸酶抑制劑可為螯合劑例如EDTA，防腐劑可為金屬疊氮化物，和蛋白酶可為蛋白酶K。通常，在70至100 C之間的溫度，例如，90對大多數樣品，上面描述的裂解試劑和條件足以獲得細胞的裂解和將核酸釋放到溶液中。不幸的是，對一些樣品類型，裂解造成了主要挑戰。一些細胞、生物和組織需要劇烈的裂解條件以破壞細胞壁或組織和釋放細胞內含物。例如，革蘭氏陽性病原體例如結核分支桿菌iMercwAxsis)具有富含脂類的肽聚糖細胞壁。檢測結核分支桿菌和其他分支桿菌的快速方法是世界范圍內的需要。然而，核酸分離經常是達到測定靈敏度期望水平的限制因素。見Neonakis等人(2008) Molecular diagnostic tools inmycobacteriology, J. Microbiol. Methods, 75:111 目前，在分支桿菌檢測測定中的期望靈敏度是通過包括重復洗滌和離心步驟的多步驟核酸分離程序得到。見Shamputa等人(2004) Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens,122:728。然而這樣的程序不可自動化，且對大多數使用者不實用。在使用MGP分離核酸的一般方法中，在樣品中的細胞區室已被破碎以釋放核酸后，使樣品與MGP接觸以實現核酸與MGP的結合。可在裂解前將MGP加入樣品。例如，MGP可存在于將加入初始樣品的容器中。已經發現，MGP的存在不影響樣品的裂解。可選地，可首先裂解樣品，并僅在裂解步驟完成后引入MGP。為了實現與MGP的結合，一般將樣品與MGP混合并在此結合混合物中孵育足夠的時間使結合發生。通過在不同時點測定固定在磁性玻璃顆粒表面上的核酸量，或通過在不同的孵育時間后測定核酸產量，可容易地最優化此步驟。一般，10秒至30分鐘之間的孵育時間對核酸是合適的。在大多數情況下，包含釋放的核酸的裂解試劑是適于MGP結合發生的環境。然而，在有些情況下，裂解試劑使環境不適于核酸結合至磁性玻璃顆粒的表面。特別是當磁性玻璃顆粒具有未修飾的表面時，核酸和顆粒表面之間的結合依賴于例如結合混合物的PH和離子強度的條件。已經發現，核酸與MGP的最大結合發生在低pH下，例如pH 5或更低。然而，對有些應用，可能不能達到結合混合物的這樣低的pH。例如，用于裂解分支桿菌的裂解試劑具有12或更高的pH值。在用于分離分支桿菌核酸的一般程序中，在細胞裂解后的中和步驟期間降低pH，但不低于pH9。在pH 9或更高時，核酸與磁性玻璃顆粒的結合是低效的。迄今為止，通過延長的孵育時間克服此結合的低效率。這種解決問題的方式對臨床應用是不現實的。此外，延長的孵育對核酸模板的穩定性有威脅，特別是RNA模板。專利技術概述 本專利技術是從包含核酸的樣品溶液中分離核酸的方法，其包括使樣品溶液接觸能夠結合核酸的固相和包含乙烯胺化合物的結合混合物；在核酸可結合固相的條件下孵育包含固相的樣品溶液；和從溶液中分離固相。本方法任選地包含在洗脫前洗滌結合的核酸的步驟。在一些實施方案中，所述方法包括在分離后檢測核酸。本專利技術還包括用于分離核酸的反應混合物，所述混合物包含能夠結合核酸的固相和乙烯胺化合物。本專利技術也包括使用固相從樣品中分離核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠結本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.01.08 US 12/684,7621.一種從包含核酸的樣品溶液中分離核酸的方法，其包括 a.使樣品溶液與能夠結合核酸的固相和包含乙烯胺化合物的結合混合物接觸； b.在核酸可結合固相的條件下孵育包含固相的樣品溶液；和 c.從溶液中分離固相。2.權利要求I的方法，其還包括洗滌結合固相的核酸。3.權利要求I的方法，其還包括從固相洗脫核酸。4.權利要求I的方法，其中所述樣品溶液通過裂解細胞得到。5.權利要求4的方法，其中所述樣品溶液通過裂解選自芽孢桿菌梭菌iClostridium)，葡萄球菌{Staphylococcus'),鏈球菌(^Streptococcus')，腸球菌iEnterococcus),分支桿菌(Mycobacterium)及其組合的革蘭氏陽性菌得到。6.權利要求I的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物還包含金屬離子。7.權利要求6的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物包含鎂或錳離子。8.權利要求I的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物還包含堿金屬氫氧化物和去垢劑。9.權利要求8的方法，其中在步驟a中的所述結合混合物包含等體積的溶液I(50mMNaOH, 1% Trit...

【專利技術屬性】
技術研發人員：JA約翰遜，E凱格，
申請(專利權)人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：
國別省市：