一種隱性混合池測序基因克隆方法技術

本發明專利技術公開了一種隱性混合池測序基因克隆方法。此方法包括以下步驟：親本雜交構建分離群體；按個體目標性狀的差異對分離群體分池，通過高通量測序親本獲得顯性與隱性親本特異位點，與隱性混合池測序結果比較獲得候選基因；富集隱性混合池中候選基因并重測序克隆目標基因。本發明專利技術以測序為基礎，可用于任何物種，直接克隆基因本身。采用本發明專利技術的方法，工作量大為減少，速度大為加快，而且降低了風險。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于遺傳學領域，公開了。
技術介紹
自然界物種性狀豐富多樣，如株高、抗病性、產量等。從孟德爾時代起，就逐漸認識到了性狀是由遺傳因子控制，摩爾根進一步將遺傳因子明確為“基因”，并指出基因位于染色體上且呈線性排列。確定基因在染色體上具體的位置(基因定位)是研究性狀的基礎，也是分離、克隆并利用基因的前提。經典的基因定位策略源于摩爾根的連鎖理論，即染色體上相鄰基因(即基因連鎖)不能自由分離，而是傾向于整體向后代傳遞，它們所控制的性狀也傾向于同時出現。二者相鄰越近，性狀同時出現的可能性越大，重組性狀越少。因此，由重組性狀(配子)的比例可以度量二者間的距離。若已知道其中一個基因在染色體上的位置(我們稱這樣的基因為標記基因)，就可以根據重組率推斷另一個基因的位置。例如，黃色圓粒豌豆品種(基因型分別為YYRR)與綠色皺粒品種(基因型為yyrr)雜交產生F1 (基因型YyRrhF1自交可能產生YR、Yr、yR和yr 4種配子，根據F2代的性狀表現可以確定它們的比例，進而計算交換率。若交換率為1%，且已知控制顏色的Y基因位于第3染色體上，那么就可以推測，控制豌豆籽粒形狀的R基因位于第3染色體且與Y基因相距IcM0從以上的分析可以看出，經典連鎖標記定位的實質是找到與目標性狀連鎖的已知分子標記，并計算二者的交換率，進而推斷目標基因的位置。分離群體分池是基因定位的實際操作策略，仍以上述實例進行說明。以籽粒形狀為標準，將F2群體劃分為兩個部分(池)顯性池(隨機抽取的圓粒單株)和隱性池(隨機抽取的皺粒單株)，比較豌豆基因組上已知的1000個SSR標記(SSR1-SSR1000)擴增產物在這兩個池間的差異。若標記SSR17與籽粒形狀R/r連鎖，那么對籽粒形狀分池，也就相當于對SSR17分池，因此，SSR17在兩個池間的擴增產物是有差異的，相反就沒有差異，由此確定目標基因與SSR17處于同一染色體。再分析F2各個單株的表現，計算R/r與SSR17的遺傳距離，即可進一步定位R/r在該染色體上的具體位置。分子標記連鎖定位基因經過幾十年的發展，已成為基因定位的經典方法，但該方法依舊存在明顯缺陷，主要表現如下(I)經典定位方法依賴于分子標記，分子標記分為兩種，一種為通用標記，如RAPD.AFLP等，可用于任何物種，但這些標記在染色體上的位置信息不明確，因此，利用它們定位基因極為耗時耗力且十分困難，利用這類標記定位的基因相當有限。另一類標記是已知染色體信息的，如SSR標記。只要找到了與性狀連鎖的標記，就相當于找到目標基因的大致位置，目前大部分性狀是利用此類標記定位的。然而，已開發此類標記的物種只占了很少一部分，絕大部分自然界的有利基因無法通過這一方法定位、克隆和利用。(2)找到的是與目標基因連鎖的分子標記，即得到的是包含目標基因的區段，而不是目標基因本身，還需要基因預測和大量驗證工作以排除區段內非目標基因，當區段較大時，該工作十分困難甚至難以完成。而且易漏掉基因，如很小的蛋白分子、非編碼基因等。(3)要求定位群體遺傳距離大，找到連鎖標記的可能性才大。從而導致一些問題。第一，過大遺傳距離常導致性狀偏分離，需另建群體調查性狀分離比，增加了工作量。第二，遠緣雜交難以用于育種，導致基因定位理論研究與育種應用實踐脫節，這違背了基因定位的初衷。(4)精細定位時，連鎖標記與目標基因距離很近，發現多態性標記變得越來越難，常出現無標記可用的情況。另外，相鄰很近導致交換很難發生，要獲得準確的交換率，群體要求很大。而交換率計算是定量分析，需要檢查群體每一個單株，工作量十分巨大。
技術實現思路
本專利技術實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供了一種能夠準確、快速克隆目標基因的新方法。為了實現上述目的本專利技術采取的技術方案是，包括以下步驟親本雜交構建分離群體；按 每個個體目標性狀的差異對分離群體分池，獲得隱性池，通過對親本全基因組高通量測序、組裝與比對獲得顯性與隱性親本特異位點，與隱性混合池全基因組測序結果比較獲得候選位點；通過PCR檢測隱性池中每一基因型候選位點，或通過富集隱性池中候選位點后重測序的方式確定目標位點；PCR擴增克隆目標基因，并通過遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。本專利技術更具體的技術方案是，包括以下步驟(I)構建分離群體利用分別含有相對性狀的親本雜交后分離構建分離群體；(2)隱性池的獲得隨機選擇分離群體中目標性狀為隱性的個體組成隱性池；(3)DNA提取取兩個親本的組織，分別提取并獲得兩個親本的基因組DNA ;同時將隱性池中個體組織等量混合后再提取DNA，或提取DNA后等量混合，獲得隱性池DNA ；(4)確定候選位點按高通量測序流程分別構建親本與隱性池文庫，PCR并高通量測序；按如novo (直接)組裝方式，初步構建兩親本與隱性池全基因組，比對兩親本基因組序列，分別獲得顯性親本與隱性親本中的特異片段；進一步分析親本基因組后，獲得特異片段可能的等位關系；將顯性親本中的特有片段與隱性池測序片段對比，獲得隱性池中沒有出現過的片段，即為候選位點；(5)目標基因克隆通過對隱性混合池中每一單株的每一候選位點進行PCR擴增，或在隱性池中富集候選位點后再次高通量測序，檢測顯性親本中特有的候選位點是否在隱性池中出現，若沒有出現，則為目標性狀的基因位點；通過比對親本基因組的方式獲得基因的全長序列，PCR擴增克隆目的基因；(6)克隆基因的功能驗證按通用遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。所述親本雜交構建分離群體最好利用遺傳距離近的純系親本構建，且距離越近越好。 本專利技術實施例的有益效果是(I)可應用于任何物種。本專利技術以測序為基礎，不需要分子標記，可應用于任何物種，大大拓寬了對自然界基因利用的范圍，對基因克隆產生了實質性的進步。(2)直接克隆基因本身。傳統克隆方法需要定位基因，獲得的是包含目標基因的區域。相比較，本專利技術直接克隆了目標基因。(3)工作量大為減少，速度大為加快。傳統克隆方法耗時數年是很正常的，本專利技術群體構建完成后，只需要提取3份DNA、富集I份DNA，并進行2次高通量測序即可完成實驗，可在數月內完成，工作量大為減少，速度大為加快。(4)風險大為降低。傳統克隆方法常因缺乏足夠或合適的標記而失敗。本方案中，只要保證測序覆蓋度，即可發現目的基因。大部分步驟有概率保證，具有判斷的標準。比如，在隱性池中測得的序列，可以與顯性親本或隱性親本序列組成比較，以排除測序誤差、基因突變等偶然因素的影響。附圖說明圖I是本專利技術實施例I提供的基因克隆方法流程示意圖； 圖2是本專利技術實施例2提供的水稻高桿基因克隆方法流程示意圖；圖3是本專利技術實施例2提供的H3與H41位點PCR擴增結果圖。圖 3 中M DL2000 Marker。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本專利技術作進一步說明，但不作為對本專利技術的限定。實施例I :(參見圖I)(I)構建分離群體選擇具有相對目標性狀的兩個親本進行正反交(除目標性狀外，其它性狀差異越小越好，可通過突變株/野生株或回交育種產生姊妹系等方式創造這樣的親本)。根據F1的表現判斷控制性狀的基因座位是顯性還是隱性；根據正反交的性狀是否有差異，判斷是否具有細胞質效應，若沒有差異，表明不受細胞質基因影響，否則該性狀與細胞質基因相關；F1自交形成&群體。根本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種隱性混合池測序基因克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：親本雜交構建分離群體；按每個個體目標性狀的差異對分離群體分池，獲得隱性池，通過對親本的高通量測序獲得顯性與隱性親本特異位點，與隱性混合池測序結果比較獲得候選位點；通過PCR檢測隱性池中每一基因型候選位點，或通過富集隱性池中候選位點后重測序的方式確定目標位點；PCR擴增克隆目標基因，并通過遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：彭海，張靜，周俊飛，章偉雄，
申請(專利權)人：江漢大學，
類型：發明
國別省市：