本發明專利技術涉及調節核酸的甲基化/去甲基化狀態的方法和試劑。本發明專利技術人首次證實，基因組DNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)都可以被Tet雙加氧酶氧化為5-羧基胞嘧啶(5caC)。胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)可以特異性地識別該5caC，并將其從基因組中切除，引起DNA主動去甲基化。因此，可基于此來調節基因組中DNA的甲基化/去甲基化作用，以及制備調節基因組中DNA的甲基化/去甲基化作用的試劑。本發明專利技術確證了細胞中基因組DNA存在5caC修飾，5caC修飾譜式可用來監測細胞狀態，并發現ATP及其類似物可以作為Tet酶的調節劑。并且，白血病中Tet突變使5caC活性降低或喪失。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物技術和藥學領域；更具體地，本專利技術涉及調節核酸的甲基化/去甲基化狀態的方法和試劑。
技術介紹
在表觀調控中，現在機制了解最清楚的是胞嘧啶第5位的甲基化。胞嘧啶甲基化直接參與到了轉錄調控和基因組的其他調控過程中。因為胞嘧啶的甲基化會引起染色體的壓縮和基因的沉默，所以對于活躍表達的基因來說，它們的啟動子和促進子區域的DNA往往處于低甲基化水平狀態。因此，DNA的去甲基化對于沉默基因的轉錄激活也起到了重要作用。·現在，特定基因位點的去甲基化和基因組規模的去甲基化都已有報道。例如，雌激素受體的目標基因PS2的啟動子區域在基因的沉默和表達循環過程中是存在主動去甲基化的。對于基因組規模的去甲基化，這種現象在原始生殖細胞中出現，被認為對于擦除父母甲基化模式并在生殖細胞中建立配子特異的甲基化譜式起到重要作用；在受精后，精子基因組的重塑也伴隨著父源基因組的大規模去甲基化，這種現象很可能對于早期胚胎的發育是重要的。現在，對于主動的去甲基化機制有多種解釋，包括打開C-C鍵直接將甲基基團從甲基胞嘧啶上切除，酶促反應將甲基基團以甲醛的形式從5hmC上移除，以及通過DNA剪切修復途徑(BER和NER)將甲基胞嘧啶直接替換。但是，現在還沒有任何一種途徑通過生物化學或者遺傳的操作在哺乳動物中得到驗證。理論上講，這些途徑都可以被Tet氧化5mC為5hmC來啟動。基于5hmC在干細胞生物學和癌癥中的重要性，近年來Tet介導的羥甲基化的研究是一個熱點。已經有多項證據顯示Tetl的功能可以逆轉起始性的DNA甲基化。但是，DNA的去甲基化即如何將甲基化的胞嘧啶逆轉成胞嘧啶是如何實現的依然未知。因此，研究DNA的甲基化/去甲基化機制，找到調節DNA的甲基化/去甲基化的關鍵分子或方法，是本領域人員需要進一步探索的，有助于從根本上了解DNA的修飾或變異。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供調節核酸的甲基化/去甲基化狀態的方法和試劑。在本專利技術的第一方面，提供一種DNA去甲基化的方法，包括(I)以Tet雙加氧酶處理DNA，將DNA中5_甲基胞嘧啶(5mC)或5_羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉變為5-羧基胞嘧啶(5caC)；(2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)處理步驟(I)獲得的DNA，將DNA中5-羧基胞嘧啶切除。(3)通過DNA剪切修復途徑(BER或NER)，在5_羧基胞嘧啶切除位點加上非甲基化的胞嘧啶。在一個優選例中，步驟(2)中以胸腺卩密唳DNA糖基化酶處理DNA的同時,還加入GADD45A (Growth arrest andDNA-damage-inducible 45, alpha)。在一個優選例中，所述的方法為非(疾病)治療方法，以及非(疾病)診斷方法。在另一優選例中，所述的方法是體外方法。在另一優選例中，所述方法還包括在本專利技術的另一方面，提供一種將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5_羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉變為5-羧基胞嘧啶(5caC)的方法，包括以Tet雙加氧酶處理DNA。(較佳地，所述方法為非治療性和非診斷性的)。在另一優選例中，在以Tet雙加氧酶處理DNA時，還包括加入Fe2+和/或2_酮戊二酸；或加入可形成(如通過水解)Fe2+和/或2-酮戊二酸的物質。 在另一優選例中，以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理DNA的同時，還加入GADD45A。在本專利技術的另一方面，提供一種將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的方法，包括以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)處理DNA。較佳地，所述方法為非治療性和非診斷性的。在本專利技術的另一方面，提供Tet雙加氧酶或其促進劑的用途，用于將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉變為5-羧基胞嘧啶(5caC);或用于制備將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉變為5-羧基胞嘧啶(5caC)的組合物。較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的。在另一優選例中，所述的Tet雙加氧酶包括Tetl、Tet2或Tet3或它們的保留催化結構域并具有催化活性的片段或衍生物(如Tetl⑶、Tet2⑶或Tet3⑶)。在另一優選例中，所述的Tet雙加氧酶的促進劑是可重組表達Tet雙加氧酶的表達載體。例如，PCDNA4載體，其中包含Tet雙加氧酶(包括Tetl、Tet2或Tet3或它們的保留催化活性的片段或衍生物(如Tetl⑶、Tet2⑶或Tet3⑶))的基因表達盒。在本專利技術的另一方面，提供Tet雙加氧酶的抑制劑的用途，用于抑制DNA中5_甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉變為5-羧基胞嘧啶(5caC);或用于制備抑制DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉變為5-羧基胞嘧啶(5caC)的組合物。(較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的)。在另一優選例中，所述的Tet雙加氧酶的抑制劑是抗Tet雙加氧酶的抗體，干擾Tet雙加氧酶表達的干擾分子(如siRNA，shRNA)。在本專利技術的另一方面，提供胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑的用途，用于將DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物。(較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的)。在另一優選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶包括全長的胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其保留酶活性的片段或衍生物(如Flag-TDG)。在另一優選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的促進劑是可重組表達胸腺嘧啶DNA糖基化酶的表達載體。例如，pcDNA4載體，其中包含胸腺嘧啶DNA糖基化酶的基因表達盒。在本專利技術的另一方面，提供胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑的用途，用于抑制DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備抑制DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物。較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的。在另一優選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑是抗胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抗體，干擾胸腺嘧啶DNA糖基化酶表達的干擾分子(如siRNA，shRNA)。在另一優選例中，所述的干擾胸腺嘧啶DNA糖基化酶表達的干擾分子是針對GenBank登錄號NM172552中第573-593位或第1180-1200位核苷酸的siRNA分子或shRNA分子。在本專利技術的另一方面，提供一種DNA去甲基化的試劑盒，其中包括Tet雙加氧酶或其促進劑；和胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑。 在另一優選例中，所述的DNA去甲基化試劑盒還包括GADD45A或其促進劑。在另一優選例中，所述的GADD45A的促進劑是可重組表達GADD45A的表達載體。例如，pcDNA4載體，其中包含GADD45A的基因表達盒。在本專利技術的另一方面，提供一種抑制DNA去甲基化的試劑盒，其中包括Tet雙加氧酶的抑制劑；和胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑。在本專利技術的另一方面，提供一種篩選調節DNA甲基化/去甲基化狀態的潛在物質的方法，包括(I)用候選物質處理表達Tet雙加氧酶的體系；和(2)檢測所述體系中Tet雙加氧酶的轉錄、表達或活性；其中，若所述候選物質可提聞(優選顯者提聞，如提聞20%以上,較佳的提聞50% ;更佳的提高80%以上)Tet雙加氧酶的轉錄、表達或活性，則表明該候選物質是促進DNA去甲基化的潛在物質；若所述候選物質可降低(優選顯著降低，如降低20%以本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種DNA去甲基化的方法，包括：(1)以Tet雙加氧酶處理DNA，將DNA中5？甲基胞嘧啶或5？羥甲基胞嘧啶轉變為5？羧基胞嘧啶；(2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理步驟(1)獲得的DNA，將DNA中5？羧基胞嘧啶切除。(3)通過DNA剪切修復途徑，在5？羧基胞嘧啶切除位點加上非甲基化的胞嘧啶。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：徐國良，
申請(專利權)人：中國科學院上海生命科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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