本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，特點(diǎn)是一對(duì)NDRG4基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特異性測序引物，具體核苷酸序列如下：上游引物：5'??AGGGTTGGGGGTTTTAGA?3'；下游引物：5'?Biotin?CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT?3'?；測序引物：5'?GGGGTTTTAGAGTGTAT?3'，優(yōu)點(diǎn)是檢測簡單方便、針對(duì)性強(qiáng)、檢測準(zhǔn)確率和效率高，用于制備胃癌早期診斷的試劑或試劑盒。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種輔助胃癌早期診斷的方法，尤其是涉及一種用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤，為世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病率和病死率高居全球第4位和第3位，是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。在中國，胃癌的發(fā)病率達(dá)29.9/10萬，死亡率達(dá)22.3/10萬。與世界各國相比，中國胃癌人群中男、女性世界癌癥死亡率高居于首位。隨著醫(yī)療手段的發(fā)展及健康觀念的普及，盡管胃癌的發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢，但總體預(yù)后仍然較差。因胃癌患者的起病癥狀不典型和胃的解剖位置的特點(diǎn)等原因，使得胃癌的早期診斷和及時(shí)治療受到較大的限制，臨床發(fā)現(xiàn)的胃癌多處于晚期，從而使患者失去最佳治療時(shí)期。同時(shí)臨床亦有大量事實(shí)證明，惡性腫瘤若在病變初期就給予及時(shí)治療，其治愈率可迅速提高。從疾病篩查和預(yù)防角度來看，胃癌發(fā)病機(jī)制的研究，尤其是應(yīng)用于早期診斷方面的生物標(biāo)記物相關(guān)研究迫在眉睫。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因異常表達(dá)累積的病變過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了遺傳學(xué)改變，表觀遺傳學(xué)改變亦參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。表觀遺傳學(xué)修飾是指不涉及基因組的堿基序列改變，卻能導(dǎo)致可遺傳性的表型變異，主要包括DNA甲基化修飾、組蛋白修飾、RNA編輯等。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾，異常的DNA甲基化水平將導(dǎo)致基因表達(dá)異常。腫瘤基因組CpG島甲基化的改變以高甲基化為主。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)研究的逐漸開展和深入，基因體區(qū)的甲基化變化在調(diào)控基因表達(dá)過程中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用，研究人員發(fā)現(xiàn)，3’端CpG位點(diǎn)的甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系最為密切，揭示其為胃癌發(fā)生的另一重要機(jī)制。因此，抑癌基因基因體區(qū)CpG島高甲基化的發(fā)生也可作為胃癌早期診斷的生物標(biāo)志物。另外，與遺傳學(xué)改變不同，甲基化過程不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過逆轉(zhuǎn)甲基化過程，沉默的抑癌基因可能重新表達(dá)，這也為胃癌的治療提供了一條新途徑。N-myc下游調(diào)控基因4（N-Myc downstream regulated gene 4，NDRG4）屬于NDRG家族成員之一，能通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)作用。目前，NDRG4與腫瘤相關(guān)性的研究備受重視。有研究表明，NDRG4的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而降低，提示NDRG4基因的抑癌效應(yīng)具有腫瘤細(xì)胞來源特異性。另外，NDRG4基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較正常結(jié)腸組織明顯降低，且其表達(dá)量增加可減少腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，提示該基因甲基化可作為臨床對(duì)腫瘤早期診斷的候選指標(biāo)。本項(xiàng)目采用焦磷酸測序方法檢測胃癌患者癌組織與癌旁組織DNA中NDRG4基因3’端CpG島的甲基化水平，提供操作簡便、特異性好、周期短、檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠的甲基化定量檢測方法，同時(shí)為患者的治療隨訪和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。目前，國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于在胃癌中運(yùn)用焦磷酸測序法檢測NDRG4基因3’端CpG島甲基化程度的檢測試劑盒的相關(guān)研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測簡單方便、針對(duì)性強(qiáng)、檢測準(zhǔn)確率和效率高的用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。本專利技術(shù)解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，包括一對(duì)NDRG4基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特異性測序引物，具體核苷酸序列如下：上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ；下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ；測序引物：5'-GGGGTTTTAGAGTGTAT-3' 。還包括甲基化特異性PCR反應(yīng)體系，其組成為：ZymoTaq PreMix 10.0 ul；濃度為5 μM的上、下游引物各1.0 μl；H2O 6.5 μl，甲基化修飾的DNA樣本模板1.5 μl；PCR反應(yīng)條件如下： 95℃ 預(yù)變性10min； 95℃變性30s，55.4℃退火40s，72℃延伸1min，共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72℃ 7min。上述用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒的用途，其特征在于：用于制備胃癌早期診斷的試劑或試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：本專利技術(shù)用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其用途，所述的檢測試劑盒包含用于檢測NDRG4基因3’端CpG島甲基化的一對(duì)特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測序引物。該試劑盒通過焦磷酸測序技術(shù)檢測人體組織中是否存在胃癌早期NDRG4基因甲基化修飾變化。此技術(shù)的基本原理：采用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化并變性為單鏈后，向其中加入四種酶的混合物：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶及三磷酸腺苷雙磷酸酶。在測序過程中，每次加入一種類型的dNTP，若該dNTP能與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)，則在四種酶的作用下發(fā)生一系列的反應(yīng)，最終將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)體現(xiàn)出來，顯示為一個(gè)個(gè)高度不一的峰，峰的高度與堿基的個(gè)數(shù)成正比。反之，當(dāng)dNTP不能與模板鏈結(jié)合時(shí)，將直接被三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，相應(yīng)的將不會(huì)顯示峰值。原始數(shù)據(jù)會(huì)被軟件自動(dòng)轉(zhuǎn)化為序列信息，通過軟件直接顯示的NDRG4基因甲基化率判斷受試者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。該試劑盒可解決樣本中DNA含量少、丟失率高、帶有致癌污染物等缺陷，相對(duì)傳統(tǒng)胃癌檢測技術(shù)具有發(fā)現(xiàn)早，靈敏度高，周期短、簡單、方便，檢測效率高，針對(duì)性強(qiáng)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。附圖說明圖1為根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)中450K甲基化芯片和mRNA測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性確定了NDRG4基因3’端CpG島被檢測序列所在全基因組的位置，以及所檢測的5個(gè)CpG點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果（例如CpG1與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0.88，CpG2與CpG3的相關(guān)系數(shù)為0.66）；圖2為癌組織甲基化水平檢測結(jié)果示例，如圖示CpG1到CpG5的甲基化程度分別為38%，29%，38%，36%，44%；圖中陰影部分顯示的是對(duì)應(yīng)CpG位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合該位點(diǎn)附近堿基種類可分析得到其甲基化水平（即陰影框?qū)?yīng)的上方數(shù)字）；圖3為癌旁組織甲基化水平檢測結(jié)果示例，如圖示CpG1到CpG5的甲基化程度分別為13%，9%，17%，12%，19%；圖4為NDRG4基因甲基化水平在癌組織與癌旁組織的比較；圖5為NDRG4基因甲基化在診斷胃癌時(shí)的ROC曲線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)描述。1、研究對(duì)象和樣本的收集收集浙江省杭州市某醫(yī)院2007年12月至2010年2月普外科手術(shù)切除的胃癌組織以及相應(yīng)配對(duì)的癌旁正常組織各110例，其中癌組織取自腫瘤組織的中心位置，癌旁組織距離癌組織5cm以上且為非癌組織，所有病例手術(shù)前均未行放療和化療并經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)。患者年齡21~83歲，其中男性76例，女性34例；有吸煙史30例，無吸煙史80例；有飲酒史28例，無飲酒史82例；腫瘤大小：≥6cm 43例，<6cm 67例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)胃癌TNM分期：I和II期17例，III和IV期93期；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移94例；組織分化程度：高分化或中分化47例，低分化或無分化63例。所取本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于：包括一對(duì)NDRG4基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特異性測序引物，具體核苷酸序列如下：上游引物：5'??AGGGTTGGGGGTTTTAGA?3'?；下游引物：5'?Biotin?CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT?3'；測序引物：5'?GGGGTTTTAGAGTGTAT?3'?。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于：包括一對(duì)NDRG4基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特異性測序引物，具體核苷酸序列如下：上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ；下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3'；測序引物：5'-GGGGTTTTAGAGTGTAT-3' 。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于包括甲基化特異性...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：段世偉，陳曉穎，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：寧波大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33
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