一種海參體表細菌DNA提取方法技術

本發明專利技術公開一種海參體表細菌DNA提取方法，其通過對樣品進行超低溫冷凍以降低樣品粘度，以利于樣品中的細菌分散到具有緩沖、降低粘度的洗脫液Ⅰ中；再在菌體收集步驟中，通過多次低速離心除去樣品中糊狀的多糖和蛋白；粘多糖和雜蛋白的脫除步驟中，裂解液中添加了CTAB溶液以去除粘多糖，添加蛋白酶K以進一步去除可溶性雜蛋白的干擾；最終通過洗脫液Ⅱ抽提的方法，獲得細菌DNA。本發明專利技術采用常用的試驗試劑，無需特殊的實驗條件，操作簡單，重復性好，細菌DNA提取質量高。該方法適用于從富含多糖、蛋白樣品中提取細菌DNA，具有廣泛的應用范圍、應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學領域，具體涉及一種海參體表細菌DNA提取方法。
技術介紹
近些年隨著我國水產養殖、加工業的飛速發展，仿刺參養殖與加工數量逐年遞增。開展仿刺參體表、腸道菌群多樣性分析，可以為海參的微生態·學研究提供極好的原始資料和數據、為更好的了解海參攜帶的生物信息、為我國海參養殖和加工業的健康發展提供良好幫助。細菌總DNA提取方法較多，主要有CTAB、試劑盒、苯酚氯仿抽提等方法，在實際操作中切實可行。仿刺參表皮含有大量的粘液物質，其富含蛋白質和粘多糖，按照通用細菌總DNA提取方法，根本無法正常提取到海參體表細菌總DNA，提取的細菌DNA電泳圖拖尾嚴重。根據多年的實驗摸索和反復操作，在CTAB方法基礎上，增加了樣品前處理以降低樣品的粘度，以及采用增加蛋白酶量和CTAB溶液去除雜蛋白和粘多糖物質，可獲得理想的海參體表細菌DNA。微生物在自然界分布廣泛，細菌DNA的提取極易受其所處環境的影響。通常處于空氣、水體、土壤中的細菌可采用常規的細菌DNA提取方法。而附生、寄生的細菌通常處于植物或動物的體表或體內，生存環境富含多糖和蛋白質等營養物質，采用常規方法很難將它們與宿主分離，因此常規方法無法獲得此類細菌DNA，這個問題一直困擾著此領域的研究者。
技術實現思路
為解決上述技術問題所采用的技術方案是在對海參體表細菌DNA提取過程中，本專利技術主要目的是去除雜蛋白、粘多糖對樣品的干擾，降低樣品粘度以利于體表細菌的溶出。首先對樣品進行超低溫冷凍以降低樣品粘度，利于樣品中的細菌分散到具有緩沖、降低粘度的洗脫液I中；在菌體收集步驟中，通過多次低速離心除去樣品中糊狀的多糖和蛋白；增加了粘多糖和雜蛋白的脫除步驟，裂解液中添加了 CTAB溶液以去除粘多糖，添加蛋白酶K進一步去除可溶性雜蛋白的干擾；最終通過洗脫液II抽提，獲得細菌DNA。本專利技術所述的一種海參體表細菌DNA的提取方法，其包括以下步驟，(I)海參樣品處理取鮮活海參用無菌生理鹽水沖洗三次，無菌封裝后，迅速放置_80°C保存24h，取出海參在無菌條件下，用無菌刀片刨刮海參體表，將刨刮物放于無菌離心管中，50mL離心管裝6 10g (濕重)海參體表刨刮物；( 2 )海參體表菌體收集①向步驟(I)獲得的離心管中，加入15 20mL洗脫液I，常溫下300rpm震蕩5 10min，使刨刮下的海參體表粘稠物與洗脫液I充分混合；②4°C下IOOOrpm離心5 8min，去除下層海參組織沉淀物及上層糊狀物，將剩余液體轉移到另一無菌離心管中；③重復步驟②直至完全去除沉淀物和糊狀物；④將步驟③所得液體分裝于I. 5mL離心管，并于4V IOOOOrpm離心f 2min，收集沉淀，即為海參體表菌體沉淀物；(3)粘多糖和雜蛋白的脫除于步驟④所得海參體表菌體沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀懸浮，然后55°C孵育震蕩l 3h，直到懸浮液澄清，簡短離心以去除管蓋內壁水珠。 (4)細菌破壁 上述液體中加入180uL溶菌酶(20mg/mL)，于37°C孵育酶解30min以上，期間間隔 震蕩直到產生的白色沉淀消失，簡短離心以去除管蓋內壁水珠。(5)抽提、純化⑤向步驟(4)獲得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脫液II，充分混勻后40C 12000rpm 離心 10 15min ；⑥吸取步驟⑤中上清液500uL,加入洗脫液II 500uL于I. 5mLEppendorf試管中，混勻后 4°C 12000rpm 離心 IOmin ； ⑦吸取步驟⑥中上清液400uL，加入無水乙醇(事先于-20 V預冷)800uL于1.5mLEppendorf 試管中，混勻后-20°C靜置 20min,4°C下 12000rpm 離心 IOmin ；⑧白色沉淀用70%的乙醇洗滌2 3次，晾干后溶于IOOuL無菌超純水中，輕輕震蕩直至沉淀溶解，或放置于50uL緩沖液TE中，于-20°C條件下貯存。其中，本專利技術上述技術方案中使用的部分試劑的配制方法如下洗脫液I :磷酸二氫鉀0. 27g，磷酸氫二鈉1. 42g，氯化鈉8g，氯化鉀0. 2g，加去離子水約700mL充分攪拌溶解,用鹽酸調pH至7. 4,最后定容到1L。然后加入200mL的CTAB溶液，高溫高壓滅菌后室溫保存。裂解液3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β -巰基乙醇和30uL蛋白酶K (50mg/Π Τ,)ηCTAB 溶液100mmol/L Tris-Hcl, 20mmoI/L 的 EDTA，I. 4mol/L 的 NaCl。5XTE 緩沖液將 Tris 54g，硼酸 25g，0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) 20mL，加去離子水定各至IL后,混勾后放在4 C冰箱中保存。洗脫液II :異戊醇氯仿的體積比為1:24。本專利技術的創新特征是采用常用的試驗試劑，無需特殊的實驗條件，操作簡單，重復性好，細菌DNA提取質量高。該方法適用于從富含多糖、蛋白樣品中提取細菌DNA，具有廣泛的應用范圍和應用前景。附圖說明圖I為利用試劑盒法提取的細菌總DNA電泳圖，其中泳道I為DL15000MARK，泳道2、3為細菌DNA，拖尾嚴重。圖2為利用CTAB法提取的細菌總DNA電泳圖，其中泳道I為DL2000MARK，泳道2、3為細菌DNA，有拖尾干擾。圖3為利用苯酚氯仿法提取的細菌總DNA電泳圖，其中泳道I為DL15000MARK，泳道2、3為細菌DNA，拖尾嚴重。圖4 :為利用本實驗方法提取的細菌總DNA電泳圖，其中泳道I為DL15000MARK，泳道2、3為細菌DNA，細菌DNA提取質量高。圖5 :細菌16S rRNA電泳圖，其中泳道1、4的Marker為DL2000MARK，中間泳道2、3為PCR產物，大小約1500bp。圖6 :陽性克隆子進行菌落PCR擴增電泳圖，其中泳道I和12均為DL2000MARKplus5, OOObp 3，OOObp，泳道 2 11 為 PCR 擴增產物，大小約為 1650bp。圖7 :仿刺參體表細菌系統發育樹。 具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本專利技術，但不以任何方式限制本專利技術。本專利技術實施例中所述方法中涉及的溶液，按下述方法配制洗脫液I :磷酸二氫鉀0. 27g，磷酸氫二鈉1. 42g，氯化鈉8g，氯化鉀0. 2g，力口去離子水約700mL充分攪拌溶解,用鹽酸調pH至7. 4,最后定容到1L。然后加入200mL的CTAB溶液，高溫高壓滅菌后室溫保存。裂解液3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β -巰基乙醇和30uL蛋白酶K (50mg/Π Τ,)ηCTAB 溶液100mmol/L Tris-Hcl, 20mmoI/L 的 EDTA，I. 4mol/L 的 NaCl。5XTE 緩沖液將 Tris 54g，硼酸 25g，0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) 20mL，加去離子水定各至IL后,混勾后放在4 C冰箱中保存。洗脫液II :異戊醇氯仿的體積比為1:24。實施例II、海參樣品處理取剛打撈上來的鮮活仿刺參用無菌生理鹽水沖洗三次，無菌封裝后，迅速放置_80°C保存24h，取出海參在無菌條件下，用無菌刀片刨刮海參體表，將刨刮物放于無菌離心管中，每個50mL離心管裝約6g海參體表本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種海參體表細菌DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步驟，（1）海參樣品處理：取鮮活海參用無菌生理鹽水沖洗三次，無菌封裝后，迅速放置？80℃保存24h，取出海參在無菌條件下，用無菌刀片刨刮海參體表，將刨刮物放于無菌離心管中，50mL離心管裝濕重6~10g的海參體表刨刮物；（2）海參體表菌體收集：①向步驟（1）獲得的離心管中，加入15~20mL洗脫液Ⅰ，常溫下300rpm震蕩5~10min，使刨刮下的海參體表粘稠物與洗脫液Ⅰ充分混合；②4℃下1000rpm離心5~8min，去除下層海參組織沉淀物及上層糊狀物，將剩余液體轉移到另一無菌離心管中；③重復步驟②直至完全去除沉淀物和糊狀物；④將步驟③所得液體分裝于1.5mL離心管，并于4℃10000rpm離心1~2min，收集沉淀，即為海參體表菌體沉淀物；（3）粘多糖和雜蛋白的脫除：于步驟④所得海參體表菌體沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀懸浮，然后55℃孵育震蕩1~3h，直到懸浮液澄清，簡短離心以去除管蓋內壁水珠；（4）細菌破壁上述液體中加入180uL的濃度為20mg/mL溶菌酶，于37℃孵育酶解至少30min，期間間隔震蕩直到產生的白色沉淀消失，簡短離心以去除管蓋內壁水珠；（5）抽提、純化：⑤向步驟（4）獲得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脫液Ⅱ，充分混勻后4℃12000rpm離心10~15min；⑥吸取步驟⑤中上清液500uL，加入洗脫液Ⅱ500uL于1.5mLEppendorf管中，混勻后4℃12000rpm離心10min；⑦吸取步驟⑥中上清液400uL，加入于？20℃預冷的無水乙醇，800uL于1.5mL？Eppendorf管中，混勻后？20℃靜置20min，4℃下12000rpm離心10min；⑧白色沉淀用70%的乙醇洗滌2~3次，晾干后溶于100uL無菌超純水中，輕輕震蕩直至沉淀溶解，或放置于50uL緩沖液TE中，于？20℃條件下貯存。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：侯紅漫，張公亮，高美玲，孫黎明，王璐，
申請(專利權)人：大連工業大學，
類型：發明
國別省市：