一種應用多重PCR陣列技術的核酸檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種應用多重PCR陣列技術的核酸檢測方法。包括：通用標簽(UT)序列，通用標簽序列與特異性檢測引物組成的引物對(5’-UT引物+特異檢測引物-3’)，含有該通用標簽序列或引物對的試劑盒，及其它們在核酸生物檢測中的應用。所述UT序列滿足以下條件：①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過±1℃，且大于檢測引物Tm值5-10℃左右；②UT序列為隨機設計的DNA片段，與待檢測生物的序列間無同源性。本發明專利技術的檢測方法，通過mPCR結合通用標簽序列的方法，以提高核酸檢測的靈敏度和特異性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種核酸檢測方法，特別涉及應用多重PCR陣列技術檢測核酸的方法，屬于生物

技術介紹
多重PCR技術(multiplex PCR, mPCR)是自上世紀80年代PCR技術誕生以來，該
的又一大革新。傳統PCR技術僅使用一對引物，通過擴增產生一個核酸片段，多用于單一目的序列的鑒定。而mPCR是在同一 PCR反應體系里應用兩對以上的引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與經典的PCR相同。mPCR最大的特點就是提高了檢測的效率，使PCR成為了一種高通量的手段(I)高效性，在同一 PCR反應管內同時檢出多種待測靶物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一個樣本就可檢測多種靶標；(2)系統性，mPCR很適宜于成組靶標，如肝炎病毒、腸道致病性細菌、性病、食品微生物及細菌戰劑等類別中不同病原體的同時檢測；(3)經濟性，多種靶標在同一反應體系內同時檢出，則在時間、試劑、費用開支等方面的耗費都是很大的節省。mPCR技術在生物醫學領域應用廣泛。比如多種病原微生物的同時檢測或鑒定，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定等。針對待檢對象的多型別，或多位點基因突變等問題，mPCR可提高其檢出率。在具體應用中，為了提高檢測的特異性，引物的設計與選擇則顯得尤為重要。同時針對多個基因靶序列進行PCR檢測，往往出現為了保證引物的特異性，而使得多對長短不一，GC含量有明顯差異的引物間Tm值難以統一的現象，給整個mPCR體系的退火溫度程序設置帶來困難，從而減低了 mPCR檢測的靈敏度。本專利技術針對這一問題，通過mPCR技術結合通用標簽序列(universal tag, UT)的方法,即在每條原有檢測引物的5’端加上一個自行設計的、Tm值統一的UT引物，使得多對引物在擴增中實現退火溫度的統一，提高反應的效率。與此同時，該專利技術還可實現多物種混合樣本、多個mPCR體系的同時實施，即mPCR陣列。總而言之，對于普通mPCR而言，本專利技術的主要特點是使得mPCR中多重引物的不同退火溫度得以統一，促進了反應的進行，提高檢測靈敏度。此外，由于反應體系中UT的Tm值相對普通檢測引物偏高，使得PCR的特異性也有所提高。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種核酸檢測方法，通過mPCR結合UT的方法，以提高核酸檢測的靈敏度和特異性。本專利技術的技術方案一種應用mPCR陣列技術的核酸檢測方法本專利技術的一個目的是提供通用標簽(UT)序列，其由20-24個堿基組成，其特征在于①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過±1°C，且大于檢測引物Tm值5-10°C左右■級UT序列為隨機設計的DNA片段，與待檢測生物的核酸序列間無同源性。優選，所述UT序列由多組四個堿基組成的隨機四聚體，該四聚體應滿足(I)四聚·體間至少要有兩個堿基是互不相同的；(2)四聚體之間不能彼此互補；(3)四聚體不應自身配對；(4)四聚體不能由兩個重復堿基對組成。更優選，所述UT序列，其由6組隨機四聚體組成。進一步優選，所述UT序列由以下6組隨機四聚體組成CAGC、GGTA、GACC、ACCT、ATCG、TGCG。進一步優選，UT序列具體是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGAC ;和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGAC ;和 / 或 FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACC ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGAC 本專利技術的另一個目的是提供一種引物對，含有上述UT序列以及檢測引物對，其中UT序列加在每條檢測引物的5’端。優選，引物對是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCCTGAATCTTCTGGTAAAAC ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC ；和/或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCATTATCACGGTAATTAGTG ；R CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACAGAGCACTGTGCACTTAAG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGTAATGCTTTGATCGGCTT ；R:CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。優選，引物對是FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGCAACCGTACAGAATGAAGCGG ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTTATTCGTGCAATACTCGTGCG ;和 / 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGATTTCTGTAACAGCTACCAACGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC ；和/ 或FCAGCGGTAGACCACCTATCGTGCGGCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA ；RCTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACGACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG。還優選，引物對是FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGCGGTAGGTGGTTCAA ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACTTGTCGCGGATTTGCAACTA 和 / 或FGGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCGCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC ；R AGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACCTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT ；和/ 或F GGTAACCTTGCGCAGCATCGGACCCGGCTCGTTTATCGGCTT ；RAGCCTTGAGGACCTGTAGCCGGACGGTATTTCGTTTCAGCCAAGCo仍優選，引物對是FTGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGAGTACCAAACTGCTAACACAGGTACTC ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACAGCTGGTTTGCAGCTTC ;和 / 或F TGCGCAGCATCGACCTGGTAGACCGCTGATTTAAGAGATAGAGGAACA ；RGGACCTGTAGCCTTGAAGCCGGACTTTATGTGGTTATTTGCTGTC ;和 / 或 FTGCGCAGCATCGACCT GGTAGACCT CCGCCTGCAAGTCCTAAG ；R:CTGTAGCCGGACTTGAAGCCGGACTGGATTGCACTTCATCTTGG。本專利技術的另一個目的是提供一種試劑盒，其中含有上述UT序列或的引物對。本專利技術的另一個目的是的提供上述UT序列、引物對、試劑盒在非診斷目的的生物檢測中的應用。本專利技術的另一個目的是上述UT序列、引物對、試劑盒用于檢測鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii),尤其是它的 recA、16S-23S ITS、0XA-51 樣基因。本專利技術的另一個目的是上述UT序列、引物對、試劑盒用于檢測肺炎鏈球菌(Streptococc本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種引物對，含有通用標簽序列(UT序列)，以及檢測引物對，且UT序列加在每條檢測引物的5’端；其中，所述UT序列由20？24個堿基組成，并滿足以下條件：①上下游引物的UT序列不同、Tm值相差不超過±1℃，且大于檢測引物Tm值5？10℃左右；②UT序列為隨機設計的DNA片段，與待檢測生物的核酸序列間無同源性。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：杜蓬，張磊，邵世和，孫愛華，王黎芳，周海鷗，銀國利，何方，蔣錦琴，花扣珍，覃江鳳，
申請(專利權)人：浙江醫學高等專科學校，
類型：發明
國別省市：