質粒型載體、基因啟動子活性的檢測方法、及分析試劑盒技術

質粒型載體、基因啟動子活性的檢測方法、及分析試劑盒本發明專利技術的課題是以高靈敏度檢測基因啟動子的活性。本實施方式中涉及的質粒型載體含：基因啟動子、第1基因、第2基因、內部核糖體結合序列、轉錄終止信號序列、及復制起始序列。第1基因編碼配置在基因啟動子之下游的，用于可視化基因啟動子的活性的報告子蛋白質。第2基因編碼配置在基因啟動子之下游的復制起始蛋白質。內部核糖體結合序列配置在第1基因和第2基因之間。轉錄終止信號序列編碼用于終止第1基因和第2基因的轉錄的信號。復制起始序列被復制起始蛋白質識別。

【技術實現步驟摘要】
質粒型載體、基因啟動子活性的檢測方法、及分析試劑盒相關申請的交叉引用本申請基于2011年8月25日提交的在先日本專利申請No. 2011-183896，并要求其優先權，其全部內容通過弓I用并入本文。
本實施方式涉及質粒型載體、基因啟動子活性的檢測方法、及分析試劑盒。
技術介紹
人基因組的堿基序列被確定以來，以基因組信息作為基礎的疾病的新的診斷法的開發被期待。例如，由基于基因組的堿基序列信息的基因解析，發現了以癌為首的多種疾病關聯基因。這些的疾病關聯基因或疾病關聯蛋白質作為癌等的疾病的診斷用生物標記物(bio-marker)而被關注。但是，由生物標記物檢測的診斷由于在疾病的早期得不到必然充分的生物標記物的表達等的原因，得不到穩定的結果是現狀。疾病的早期診斷，即便從治愈率的升高或患者的負擔輕減的方面來看，也對今后的醫療不可或缺。作為早期診斷的一種方法，可舉出檢測在疾病的早期表達的基因的啟動子活性的變化的方法。通過基因啟動子的活性變化，基因的表達概率被控制。基因啟動子的活性相比疾病關聯基因或疾病關聯蛋白質的表達更早期被觀察到。作為檢測細胞內的基因啟動子的活性的方法，可舉出報告子基因分析(reportergene assay)。報告子基因分析是將連結用于可視化啟動子的活性的報告子基因的表達盒整合到所述啟動子之下游的報告子載體導入被檢細胞而基于報告子蛋白質的活性定量化所述啟動子的活性的方法。作為報告子基因，采用螢光素酶基因或半乳糖苷酶基因、熒光蛋白質基因等。但是，例如，在疾病早期，基因啟動子的活性變化而處于前疾病化的狀態的細胞是極其少數。為診斷采集的血液或組織中含所述細胞的概率說不上高。因此，需求在疾病的早期診斷等，高靈敏度的檢測技術。現在，作為高靈敏度的報告子基因分析，報告了由基因啟動子和熒光蛋白質整合到病毒(virus)的基因組的病毒型報告子載體的方法。在此報告子基因分析中，通過在感染病毒載體的宿主細胞之內部增殖所述病毒載體，增加熒光蛋白質的表達量，使報告子基因分析高靈敏度化。但是，病毒型報告子載體在向宿主細胞的所述載體的導入中利用病毒的感染能力。因此，有病毒型報告子載體感染操作者的危險性。從而，病毒型報告子載體的操作不簡便，安全性成為課題。另一方面，質粒型報告子載體相比病毒型報告子載體更操作簡便，并且也不具有感染性而安全性高。使用質粒型報告子載體的報告子基因分析也有很多報告。期待向疾病的早期診斷的質粒型報告子載體的適用。但是，質粒型載體與病毒型報告子載體不同，在宿主細胞之內部不增殖，因此其檢測靈敏度有問題。現有技術文獻非專利文獻lKojimaT.、JCL、2009 年、第 119 卷、p3172_8
技術實現思路
專利技術要解決的技術課題實施方式的目的是提供可以高靈敏度檢測基因啟動子的活性的質粒型載體、基因啟動子的檢測方法、及分析試劑盒。解決課題的技術方案本實施方式中涉及的質粒型載體具備基因啟動子；以及第I基因，其編碼配置在上述基因啟動子之下游的，用于可視化上述基因啟動子的活性的報告子蛋白質；以及第2基因，其編碼配置在上述基因啟動子之下游的復制起始蛋白質；以及內部核糖體結合序列，其配置在上述第I基因和上述第2基因之間；以及轉錄終止信號序列，其編碼用于終止上述第I基因和上述第2基因的轉錄的信號；以及復制起始序列，其被上述復制起始蛋白質識·別。專利技術效果以高靈敏度檢測基因啟動子的活性。附圖說明圖I是示本實施方式中涉及的質粒型載體的結構的模式圖。圖2是示使用圖I的質粒型載體的，基因啟動子活性的檢測方法(報告子基因分析)的全過程的圖。圖3是示本實施方式中涉及的質粒型載體pCMV-Luc-IRES-LT的制備方法的典型流程的模式圖。圖4A是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT的結構的模式圖。圖4B是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-E107K的結構的模式圖。圖4C是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的結構的模式圖。圖5是示本實施方式中涉及的陰性對照用的載體pCMV-Luc的制備方法的典型流程的模式圖。圖6是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc中的LT蛋白質的表達量的檢測結果的圖。圖7A是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的拷貝數的比較結果的圖，是示pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的溴化乙錠染色照片的圖。圖7B是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的拷貝數的比較結果的圖，是示用于pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的拷貝數的比較的圖。圖8是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV_Luc的報告子蛋白質的發光信號的檢測結果的圖。圖9是示本實施方式的實施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT和pCMV-Luc-IRES-LT-E107K和 pCMV-Luc-IRES-LT-D402E 的對pCMV-Luc 的報告子蛋白質的信號強度的比較結果的圖。圖10是示使用以往例中涉及的非擴增型的報告子載體的，基因啟動子活性的檢測方法的全過程的圖。符號說明I···質粒型載體、10···基因啟動子、21···報告子基因、23···內部核糖體結合序列(IRES)、25···復制起始蛋白質基因、27···轉錄終止信號序列、30···復制起始序列實施方式本實施方式中涉及的質粒型載體含基因啟動子、第I基因、第2基因、內部核糖體結合序列、轉錄終止信號序列、及復制起始序列。第I基因編碼配置在基因啟動子之下游的，用于可視化基因啟動子的活性的報告子蛋白質。第2基因編碼配置在基因啟動子之下 游的復制起始蛋白質。內部核糖體結合序列配置在第I基因和第2基因之間。轉錄終止信號序列編碼用于終止第I基因和第2基因的轉錄的信號。復制起始序列被復制起始蛋白質識別。以下，參照附圖說明本實施方式中涉及的質粒型載體、基因啟動子的檢測方法、及分析試劑盒。本實施方式中涉及的質粒型載體是通過檢測對象的基因啟動子在活化的宿主細胞中特異性地自身擴增來增強檢測信號的質粒型的報告子載體。質粒型載體的結構圖I是示作為本實施方式中涉及的自身擴增型報告子載體的質粒型載體I的結構的模式圖。如圖I所示，本實施方式中涉及的質粒型載體I有成為檢測對象的基因啟動子10。在成為檢測對象的基因啟動子10之下游，配置有用于轉錄及翻譯的堿基序列20。堿基序列20含報告子基因21、內部核糖體結合序列(IRES :internal ribosome entry site)23、復制起始蛋白質基因25和轉錄終止信號序列27。在報告子基因21和復制起始蛋白質基因25之間配置有IRES23。復制起始蛋白質基因25之下游配置有轉錄終止信號序列27。另外，質粒型載體I在通過報告子基因21或復制起始蛋白質基因25的側的基因啟動子10和轉錄終止信號序列27之間以外的部位有復制起始序列30。再有，IRES23之上游配置有報告子基因21，下游配置有復制起始蛋白質基因25，但本實施方式不限于此。例如，在IRES23之上游配置有復制起始蛋白質基因25，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
質粒型載體，其具備：基因啟動子、以及第1基因，其編碼配置在上述基因啟動子之下游的，用于可視化上述基因啟動子的活性的報告子蛋白質、以及第2基因，其編碼配置在上述基因啟動子之下游的復制起始蛋白質、以及內部核糖體結合序列，其配置在上述第1基因和上述第2基因之間、以及轉錄終止信號序列，其編碼用于終止上述第1基因和上述第2基因的轉錄的信號、以及復制起始序列，其被上述復制起始蛋白質識別。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：赤星英一，石原美津子，
申請(專利權)人：株式會社東芝，東芝醫療系統株式會社，
類型：發明
國別省市：