一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法，該技術(shù)方案首先利用PCR技術(shù)從Ⅰ群4型禽腺病毒基因組中克隆纖維蛋白C?末端的編碼基因并進行序列分析；然后將該基因克隆到表達載體pET?32a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后構(gòu)建工程菌，異丙基?β?D?硫代半乳糖苷誘導工程菌表達纖維蛋白C?末端；最后裂解工程菌細胞，離心分離其中的包含體，尿素溶解后，稀釋復性；再按常規(guī)礦物油佐劑滅活疫苗制備方法制備成疫苗。本發(fā)明專利技術(shù)制備的Ⅰ群4型禽腺病毒亞單位疫苗，利用血清學方法和免疫攻毒法評估疫苗的免疫效果，結(jié)果顯示，本發(fā)明專利技術(shù)中制備的禽腺病毒滅活疫苗對禽能夠提供有效的免疫保護，具有很好的商品化開發(fā)前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于疫苗
，同時涉及重組菌的制備及重組蛋白的表達，具體涉及一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法。
技術(shù)介紹
Ⅰ群禽腺病毒組成了腺病毒科的禽腺病毒屬。Ⅱ群(火雞出血性腸炎和相關(guān)病毒)和Ⅲ群(減蛋綜合征)腺病毒與疾病的關(guān)系明確，相比之下，大多數(shù)Ⅰ群的禽腺病毒對禽類的致病作用還未完全確定。但FAdV-1和FAdV-4明顯屬于例外，其中FAdV-1能引起鵪鶉支氣管炎，F(xiàn)AdV-4是心包積水肝炎綜合征的主要病因。當雞的健康受到損害時，如并發(fā)感染雞傳染性貧血病毒(CIAV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等其他病原，其他的腺病毒毒株可使條件性致病原發(fā)生快速感染。Ⅰ群禽腺病毒已鑒定了5個禽腺病毒，其名稱用字母A～E表示。每個種內(nèi)的病毒主要根據(jù)交叉中和實驗結(jié)果進一步分為不同的血清型。病毒顆粒直徑為70～90nm，無囊膜，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒核酸為雙股DNA，占整個病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分為蛋白質(zhì)。病毒六鄰體是主要的衣殼蛋白，含有型、群和群特異性抗原決定簇，因而感染后可產(chǎn)生相應的型、群和群的特異性抗體。Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感。可以通過水平和垂直兩種途徑傳播。雖然感染雞的12個血清型之間及血清型內(nèi)部的毒力各有不同，但12個血清型均能誘發(fā)包涵體肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)的主要臨床癥狀為產(chǎn)蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死，肝細胞中見核內(nèi)包涵體。FAV-4具有明顯的致病年齡段，對雛雞的致病力最強，可通過接觸水平傳播及垂直傳播。1987年在巴基斯坦臨近卡拉奇的安哥拉首先報道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的幾個邦、厄瓜多爾、秘魯、智利、中南美洲、俄羅斯和孟加拉國等國相繼發(fā)現(xiàn)該病。如今，世界各地都有HHS的蹤影，遍及拉丁美洲-中東和亞洲的一些國家。通過對Ⅰ群禽腺病毒的流行病學調(diào)查，該病在我國雞群中發(fā)病率較高，且呈逐年上升趨勢。發(fā)病的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病。特別是2010年以后發(fā)病呈現(xiàn)增加趨勢，在全國范圍內(nèi)均有流行。臨床表現(xiàn)包涵體肝炎(IBH)、心包積水肝炎綜合征(HHS)。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，Ⅰ群禽腺病毒的發(fā)病率給飼養(yǎng)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。關(guān)于該病的防治，國外已有預防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今國內(nèi)尚無疫苗可用，導致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。目前，F(xiàn)AV-4接種雞胚或原代雞腎臟細胞肝細胞來接種制備疫苗。雞胚繁殖病毒毒價低，病毒需要高倍濃縮，成本高昂；而原代肝腎細胞制備繁瑣、易污染、不易轉(zhuǎn)染，且在制備細胞過程中易混入雞胚成纖維細胞(CEF)，不利于實驗操作。所以急需新的抗原制備途徑。Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形態(tài)，毒粒直徑為70-90nm，無囊膜，呈球形，二十面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒粒子具有252個殼粒，240個非頂角殼粒為六鄰體，12個頂角殼粒為五鄰體，每個五鄰體有2條纖維突起。研究表明纖維突起具有良好的免役原型。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中Ⅰ群4型禽腺病毒滅活疫苗制備困難的技術(shù)問題。本專利技術(shù)要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種針對Ⅰ群4型禽腺病毒的亞單位疫苗。本專利技術(shù)要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中Ⅰ群4型禽腺病毒的亞單位疫苗由于抗原選擇不合理而導致免疫效果較差。本專利技術(shù)要解決的又一技術(shù)問題是當采用本專利技術(shù)所提供的蛋白作為抗原時，該蛋白的獲取效率較低。為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗，該疫苗以氨基酸序列為SEQIDNo:1的蛋白為抗原。一種上述Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗的制備方法，包括以下步驟：1)制備序列為SEQIDNo:1的蛋白的表達基因；2)將步驟1)所得的基因克隆到表達載體pET-32a上，得到重組質(zhì)粒；3)將步驟2)所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到重組菌；4)誘導表達步驟1)所述蛋白；5)裂解所述重組菌，而后收集并純化驟1)所述蛋白；6)利用步驟5)所得的蛋白制備疫苗。作為優(yōu)選，步驟1)中所述表達基因是利用PCR方法制備的，所述PCR的模板為FAV-4病毒，所述PCR的上、下游引物分別是序列為SEQIDNo:3的DNA和序列為SEQIDNo:4的DNA。作為優(yōu)選，所述PCR的反應條件為：94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環(huán)。作為優(yōu)選，步驟2)所述的克隆到表達載體pET-32a上，是先將步驟1)所得的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體上，得到重組載體，而后利用雙酶切的方法將所述重組載體與pET-32a質(zhì)粒相連接，即得到所述重組質(zhì)粒。作為優(yōu)選，所述雙酶切所用酶分別為EcoRI和HindIII，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pET-32a，然后16℃連接過夜。作為優(yōu)選，步驟4)所述的誘導表達，是利用終濃度為0.5mM的IPTG實現(xiàn)的。作為優(yōu)選，步驟5)所述的裂解包括以下操作：以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，收集沉淀加入結(jié)合緩沖液100ml懸浮菌體，而后進行750W超聲波破碎，而后于4℃條件下以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min，收集沉淀，即得到包涵體；其中所述結(jié)合緩沖液包含20mmol/LTris.HCl，0.5mol/LNaCl，5mmol/L咪唑；所述結(jié)合緩沖液的pH為8.0；所述超聲破碎每次工作時間10s，間隔時間20s，共破碎120次。作為優(yōu)選，步驟5)所述純化包括以下操作：將所得的包涵體溶解于尿素溶液中，而后過8mol/L尿素平衡的Ni敖合樹脂柱，而后用30mL洗脫緩沖溶液配制的8mol/L尿素洗脫目的蛋白，收集流出液，于4℃透析過夜后，冷凍干燥；其中所述洗脫緩沖溶液包含20mmol/LTris.HCl，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑；所述洗脫緩沖溶液的pH為8.0。作為優(yōu)選，所述將所得的包涵體溶解于尿素溶液中，包括以下操作：將5g包含體中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用攪拌器攪拌30min，超聲破碎40次，攪拌器繼續(xù)攪拌30min，然后低溫冷凍離心8000rpm，30min。再分別用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗滌，共洗滌4次，向最后洗滌的包含體沉淀中加入100ml濃度為8mol/L的尿素溶液，用磁力攪拌器攪拌40min，冷凍離心8000rpm，30min，保留上清。本專利技術(shù)所述的疫苗可用于預防雞心包積水肝炎綜合征。在以上技術(shù)方案中，步驟6)所述制備疫苗，是以步驟5)所得的蛋白為抗原制備疫苗，具體操作方法可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的疫苗制備方法執(zhí)行，也就是說，在以步驟1)～5)所制備的蛋白為抗原的基礎(chǔ)上，利用本領(lǐng)域任一種常規(guī)的疫苗制備方法均可達到本專利技術(shù)所預期的效果，而具體采用何種疫苗制備工藝，可以依照具體的工藝要求進行適應性選擇。本專利技術(shù)提供了一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法，該技術(shù)方案首先利用P本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗，其特征在于該疫苗以氨基酸序列為SEQ?ID?No:1的蛋白為抗原。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗，其特征在于該疫苗以氨基酸序列為SEQIDNo:1的蛋白為抗原。2.一種權(quán)利要求1所述Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1)制備序列為SEQIDNo:1的蛋白的表達基因；2)將步驟1)所得的基因克隆到表達載體pET-32a上，得到重組質(zhì)粒；3)將步驟2)所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到重組菌；4)誘導表達步驟1)所述蛋白；5)裂解所述重組菌，而后收集并純化驟1)所述蛋白；6)利用步驟5)所得的蛋白制備疫苗。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟1)中所述表達基因是利用PCR方法制備的，所述PCR的模板為FAV-4病毒，所述PCR的上、下游引物分別是序列為SEQIDNo:3的DNA和序列為SEQIDNo:4的DNA。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述PCR的反應條件為：94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進行30循環(huán)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述的克隆到表達載體pET-32a上，是先將步驟1)所得的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體上，得到重組載體，而后利用雙酶切的方法將所述重組載體與pET-32a質(zhì)粒相連接，即得到所述重組質(zhì)粒。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述雙酶切所用酶分別為EcoRI和HindIII，酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pET-32a，然后16℃連接過夜。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟4)所述的誘導表達，是利用終濃度為0.5mM的IPTG實現(xiàn)的。8.根據(jù)...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：唐宏榮，李亞杰，楊保收，付旭彬，李守軍，
申請(專利權(quán))人：天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12