一種基因工程細(xì)胞及其在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基因工程細(xì)胞及其在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用，提供了一種高效和高細(xì)胞毒性的自然殺傷（NK）細(xì)胞體外擴(kuò)增方法。通過基因工程技術(shù)在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體（4-1BBL）和膜固定白介素21（mbIL-21），構(gòu)建4-1BBL-mbIL-21-基因工程細(xì)胞（4-1BBL-mbIL-21-GeneEngineeringCells,4-1BBL-mbIL-21-GEC），如4-1BBL-mbIL-21-K562細(xì)胞等，以此作為擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞，從外周血單核細(xì)胞中直接擴(kuò)增NK細(xì)胞，更加簡單和易于操作。細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞分析、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等研究表明細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)高，NK細(xì)胞純度好、細(xì)胞毒性強(qiáng)、具有明顯的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及疾病免疫治療，尤其涉及NK細(xì)胞免疫治療中NK細(xì)胞的體外制備。
技術(shù)介紹
NK細(xì)胞(natural killer cell,自然殺傷細(xì)胞)是一類大顆粒淋巴細(xì)胞,是機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，在機(jī)體抗感染性疾病和惡性腫瘤免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要作用。繼發(fā)性NK細(xì)胞移植能產(chǎn)生良好的抗腫瘤效應(yīng)，而其自身很少被受體排斥，且不會(huì)引起任何 GVHD (Graft Versus Host Disease)。因此，繼發(fā)性 NK 細(xì)胞治療(Adoptive NKcell therapy)已成為目前最熱門和最有前途的惡性腫瘤治療方法之一。盡管繼發(fā)性NK細(xì)胞免疫治療具有良好的抗腫瘤效應(yīng)和巨大的應(yīng)用前景，但NK細(xì)胞免疫治療仍然難以進(jìn)行常規(guī)臨床應(yīng)用，其中最主要障礙在于，在外周血單核細(xì)胞(PBMC)中，NK細(xì)胞只是一個(gè)很小的群體，僅占人外周血單核細(xì)胞的10 15%，難以滿足巨大的臨床需要。為解決這一難題，首先要在數(shù)量上保證NK細(xì)胞的有效供給。因此，探索各種有效的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增(Ex vivo expansion)方法已成為NK細(xì)胞免疫治療的必然趨勢。應(yīng)用基因工程細(xì)胞(Gene engineering cells, GEC)作為飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercell)進(jìn)行NK細(xì)胞體外擴(kuò)增是一種重要的NK細(xì)胞擴(kuò)增新策略。在以往的研究中有研究者應(yīng)用CD64、CD86修飾K562細(xì)胞構(gòu)建人工抗原遞呈細(xì)胞(Antigen present cell, aAPC)，然后將 4-1BBL (CD137L)和膜固定 IL15 (membrane-bound IL-15, mIL-15)等導(dǎo)入此細(xì)胞中，構(gòu)建⑶64-⑶86-4-lBBL-mIL15-aAPC，并利用此人工抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行NK細(xì)胞體外擴(kuò)增，這種方法可以獲得較強(qiáng)細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞，但NK細(xì)胞增殖受到限制，5-6周后細(xì)胞不再擴(kuò)增。本專利技術(shù)中，我們通過基因工程技術(shù)將4-1BBL和膜固定IL21 (mbIL_21)直接修飾到K562細(xì)胞表面，構(gòu)建4-lBBL-mbIL-21-GEC。與以往的人工抗原遞呈細(xì)胞相比，本專利技術(shù)更加簡單和易于操作。研究表明，4-lBBL-mbIL-21-GEC可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大規(guī)模功能性的NK細(xì)胞，在NK細(xì)胞免疫治療臨床應(yīng)用和科學(xué)研究中具有重大應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是，提供一種基因工程細(xì)胞。本專利技術(shù)的第二個(gè)目的是，提供一種基因工程細(xì)胞的制備方法。本專利技術(shù)的第三個(gè)目的是，提供一種基因工程細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的第四個(gè)目的是，提供一種NK細(xì)胞擴(kuò)增方法。為了解決本專利技術(shù)第一個(gè)目的，本專利技術(shù)提供了一種基因工程細(xì)胞，所述基因工程細(xì)胞為4-lBBL-mbIL-21-GEC，其細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體和膜固定白介素21(mbIL-21)。作為一個(gè)優(yōu)選，所述基因工程細(xì)胞為4-lBBL-mbIL-21-K562細(xì)胞。為了解決本專利技術(shù)第二個(gè)目的，本專利技術(shù)提供了基因工程細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟(1)構(gòu)建4-1BBL表達(dá)的轉(zhuǎn)座子；(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞 4-1BBL-GEC ；(3)在步驟(2)獲得的4-1BBL-GEC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-21(membrane-bound IL-21, mbIL-21),建立 4-lBBL-mbIL_21 -GEC0作為一個(gè)優(yōu)選，所述基因工程細(xì)胞為4-lBBL-mbIL-21-K562細(xì)胞。為了解決本專利技術(shù)第三個(gè)目的，本專利技術(shù)提供了基因工程細(xì)胞在NK細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用。為了解決本專利技術(shù)第四個(gè)目的，本專利技術(shù)提供了一種NK細(xì)胞擴(kuò)增方法，利用上述基因工程細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，包括以下步驟(1)構(gòu)建4-1BBL表達(dá)的轉(zhuǎn)座子；(2)4-lBBL轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞 4-1BBL-GEC ；(3)在步驟(2)獲得的4-1BBL-GEC基礎(chǔ)上導(dǎo)入在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-21(mbIL-21)，建立 4-lBBL-mbIL-21 -GEC ；(4)致死性照射或絲裂霉素處理步驟(3)獲得的基因工程細(xì)胞，按2:I與外周血單核細(xì)胞混合，在NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中共培育；(5)每周重復(fù)刺激I次，連續(xù)數(shù)周，以獲得足夠量的NK細(xì)胞。作為一個(gè)優(yōu)選，所述基因工程細(xì)胞為4-lBBL-mbIL-21-K562細(xì)胞。本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，為建立一種高效和高細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，我們通過在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4-1BB配體(4-1BBL)和膜固定白介素21 (mbIL-21 )，構(gòu)建新型基因工程細(xì)胞4-lBBL-mbIL-21-GEC，如4-lBBL-mbIL-21_K562細(xì)胞，以此作為擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞，從外周血單核細(xì)胞中直接擴(kuò)增NK細(xì)胞，而不是先構(gòu)建人工抗原遞呈細(xì)胞，然后在此基礎(chǔ)上遺傳修飾。與以往的人工抗原遞呈細(xì)胞相比，本專利技術(shù)更加簡單和易于操作。流式細(xì)胞分析、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等表明所擴(kuò)增的NK細(xì)胞純度好、細(xì)胞毒性強(qiáng)，具有明顯的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。本專利技術(shù)提供的NK細(xì)胞擴(kuò)增方法簡單、易于操作；擴(kuò)增效率好、純度高；擴(kuò)增持續(xù)時(shí)間長、腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)明顯。附圖說明圖I為本專利技術(shù)的工作示意圖。圖2為4-1BBL和mbIL-21在4-lBBL-mbIL-21_K562基因工程細(xì)胞中的表達(dá)。圖3為擴(kuò)增細(xì)胞中NK細(xì)胞的純度(W代表擴(kuò)增周數(shù))。圖4為擴(kuò)增細(xì)胞的總數(shù)目。圖5為擴(kuò)增前后NK細(xì)胞的受體表達(dá)(W代表擴(kuò)增周數(shù)，O W代表PBMC)。圖6為擴(kuò)增前后NK細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷效率。圖7為STAT3抑制劑JSI-124抑制擴(kuò)增NK細(xì)胞受體表達(dá)。圖8為STAT3抑制劑JSI-124損害擴(kuò)增NK細(xì)胞的形態(tài)、增殖和細(xì)胞殺傷效力。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本專利技術(shù)提供的4-lBBL-mbIL-21-K562的制備方法和NK細(xì)胞擴(kuò)增方法的具體實(shí)施方式做詳細(xì)說明，圖I為本專利技術(shù)的工作示意圖。實(shí)施例I、基因工程細(xì)胞4-lBBL-mbIL-21_K562的制備方法I.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4TOPO質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達(dá)載體的Nhe I-XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子。2.將4-lBBL/pSBSO轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶SBll共轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，獲得4-1BBL 穩(wěn)定表達(dá)的 K562 細(xì)胞(4-1BBL-K562)。3.將 IL-21-Fc (CoOp)-pSBSO 與轉(zhuǎn)座酶 SBll 共轉(zhuǎn)染 4-1BBL-K562 細(xì)胞，流式細(xì)胞分選，建立4-lBBL-mbIL-21-K562基因工程細(xì)胞。流式細(xì)胞分析證實(shí)4-lBBL-mbIL-21_K562細(xì)胞表面有明顯的4-1BBL和IL-21的表達(dá)(圖2)。實(shí)施例2、NK細(xì)胞擴(kuò)增方法I.從 Open Biosysems (Thermo Fisher Scientific, CO, USA)購買 4-1BBL/PCR4TOPO質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增，然后插入GlySer-EGFP (CoOp)-pSBSO睡美人表達(dá)載體的Nhe I-Xho本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基因工程細(xì)胞，其特征在于，所述基因工程細(xì)胞為4？1BBL？mbIL？21？GEC，其細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)4？1BB配體和膜固定IL？21。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱詩國，王艷麗，
申請(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：