生產(chǎn)脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的一些方面涉及用于使用經(jīng)改造微生物將碳源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的方法。本發(fā)明專利技術(shù)的一些方面涉及發(fā)現(xiàn)微生物中脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明專利技術(shù)的一些方面涉及用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的經(jīng)改造微生物。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】生產(chǎn)脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程相關(guān)申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)，本申請要求2010年3月2日提交的美國臨時專利申請U.S.S.N.61/309,782的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
本專利技術(shù)至少部分地涉及采用經(jīng)改造的細(xì)胞或微生物將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物，如三酰甘油)的領(lǐng)域。聯(lián)邦政府資助研究導(dǎo)致本文所公開專利技術(shù)的某些方面的研究(至少部分)由能源部資助69106899支持。美國政府享有本專利技術(shù)的某些權(quán)利。
技術(shù)介紹
可持續(xù)生產(chǎn)的生物燃料是化石燃料的替代品，并且可以有助于緩解對易于得到的化石燃料儲備的消耗，同時避免與化石燃料相關(guān)的污染和溫室氣體排放，從而以可持續(xù)的方式滿足對負(fù)擔(dān)得起的能源的日益增長的需求。然而，現(xiàn)有生產(chǎn)方法的若干缺點妨礙了廣泛實施生物燃料生產(chǎn)，例如生產(chǎn)生物燃料的植物與糧食作物競爭有農(nóng)業(yè)價值的土地面積，或者使用僅有限供應(yīng)的工業(yè)物質(zhì)作為碳源。
技術(shù)實現(xiàn)思路
對化石燃料之可持續(xù)性和可再生性的日益增加的關(guān)注使得開發(fā)了不同來源的多種替代性生物燃料，包括由微生物(如細(xì)菌或酵母)從可再生資源合成的脂質(zhì)。可用作生物燃料或生物燃料前體的脂質(zhì)包括例如脂肪酸及其衍生物(例如，三酰甘油)。微生物合成的生物燃料或生物燃料前體的經(jīng)濟(jì)可行性依賴于使用具有包括多個有利特性之組合的表型的適合微生物，所述有利特性例如允許將碳有效轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的代謝、高的生物質(zhì)形成率、生物燃料或生物燃料前體的高產(chǎn)率、生物燃料或生物燃料前體的高水平細(xì)胞內(nèi)積累或分泌、對原料(碳源和相關(guān)物質(zhì))和所合成產(chǎn)物(例如，脂肪酸或三酰甘油)的良好耐受以及生物燃料或生物燃料前體的穩(wěn)定性(例如在低碳源濃度下)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)率(每克底物(例如葡萄糖)所產(chǎn)生的油的克數(shù))尤為重要。通常用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物不符合足夠允許以工業(yè)規(guī)模經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)生物燃料的所需表型。本專利技術(shù)的一些方面涉及在微生物中改造所需特性以生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體。雖然自二十世紀(jì)三十年代和二十世紀(jì)四十年代起，已研究了微生物中的脂質(zhì)和脂肪酸代謝(參見，例如Woodbine，M.1959，Microbialfat：Microorganismsaspotentialfatproducers.Prog.Ind.Microbiol.1：181)，但是，盡管在遺傳改造微生物或優(yōu)化生產(chǎn)過程的條件方面作出了諸多努力，在微生物中改造與生物燃料生產(chǎn)相關(guān)的期望表型方面的進(jìn)展仍然很小。到目前為止，遺傳改造工作主要集中在操作脂肪酸合成通路上游或其中的基因靶標(biāo)和優(yōu)化發(fā)酵或培養(yǎng)條件(例如，通過用脂肪酸補(bǔ)充生長培養(yǎng)基)。遺傳改造微生物的一個主要障礙是缺少靶微生物中(例如產(chǎn)油(oleaginous)酵母中)關(guān)鍵代謝通路調(diào)節(jié)因子的基因組信息和注釋。因此，在用于生產(chǎn)生物燃料的微生物中仍然缺少控制將碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的功能鑒定和注釋。本專利技術(shù)的一些方面涉及將產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)鑒定為用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物。本專利技術(shù)的一些方面涉及發(fā)現(xiàn)微生物中脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本專利技術(shù)的一些方面涉及發(fā)現(xiàn)硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)作為微生物中碳水化合物向脂質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本專利技術(shù)的一些方面涉及編碼微生物中脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的分離的核酸。本專利技術(shù)的一些方面提供了編碼產(chǎn)油微生物的脂肪酸代謝之關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(例如，SCD基因產(chǎn)物)的分離的核酸。本專利技術(shù)的一些方面涉及操作脂肪酸代謝調(diào)節(jié)因子的活性(例如，通過遺傳操作)來改造用于生產(chǎn)生物燃料的微生物。本專利技術(shù)的一些方面涉及改造用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的分離的微生物。本專利技術(shù)的一些方面涉及針對將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體進(jìn)行優(yōu)化的分離的微生物，例如，包含活性增加的SCD基因產(chǎn)物的產(chǎn)油微生物。本專利技術(shù)的一些方面涉及改造用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的微生物培養(yǎng)物。本專利技術(shù)的一些方面涉及使用改造用于生產(chǎn)生物燃料的微生物將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法。本專利技術(shù)的一些方面涉及使用改造用于生產(chǎn)生物燃料的微生物將碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的生物反應(yīng)器。本專利技術(shù)的一些方面提供了使用經(jīng)改造微生物至少部分地將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為生物燃料或生物燃料前體的方法。本專利技術(shù)的一些方面涉及分離的產(chǎn)油細(xì)胞，其包含提高選自血紅蛋白、細(xì)胞色素、GLUT、蘋果酸酶(malicenzyme)、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基輔酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一種或更多種基因的表達(dá)的遺傳修飾，和/或降低選自JNK2和Δ-12去飽和酶的基因的表達(dá)的遺傳修飾。在一些實施方案中，分離的產(chǎn)油細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含：(a)包含在合適的同源或異源啟動子的控制下編碼基因產(chǎn)物的核酸的表達(dá)盒；(b)包含在異源啟動子的控制下編碼靶向基因產(chǎn)物的干擾RNA的核酸的表達(dá)盒；和/或(c)插入細(xì)胞基因組的核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含提高或降低基因產(chǎn)物表達(dá)的核酸序列。在一些實施方案中，異源啟動子是誘導(dǎo)型或組成型啟動子。在一些實施方案中，核酸構(gòu)建體抑制或破壞(disrupt)編碼基因產(chǎn)物的天然基因的天然調(diào)節(jié)，導(dǎo)致天然基因的過表達(dá)。在一些實施方案中，核酸構(gòu)建體抑制或消除天然基因的表達(dá)。在一些實施方案中，由缺失、破壞、突變和/或替換調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)天然基因的天然調(diào)節(jié)的抑制或破壞，或者由缺失、破壞、突變和/或替換天然基因的編碼序列或調(diào)節(jié)天然基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)天然基因表達(dá)的抑制或消除。在一些實施方案中，由組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)靶向JNK2和/或Δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物且抑制所述基因表達(dá)的核酸來介導(dǎo)JNK2和/或Δ-12去飽和酶基因表達(dá)的降低。在一些實施方案中，靶向JNK2和/或Δ-12去飽和酶基因轉(zhuǎn)錄本的核酸通過RNAi途徑抑制轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。在一些實施方案中，靶向JNK2和/或Δ-12去飽和酶轉(zhuǎn)錄本的核酸是siRNA、shRNA或microRNA。在一些實施方案中，通過在微生物中敲除野生型基因(例如，通過核酸構(gòu)建體(如靶向性載體)與基因組JNK2或Δ-12去飽和酶基因座的同源重組)從而破壞野生型基因的表達(dá)來降低JNK2和/或Δ-12去飽和酶的表達(dá)。在一些實施方案中，將核酸構(gòu)建體插入細(xì)胞的基因組中。在一些實施方案中，基因產(chǎn)物表達(dá)的提高的或降低賦予細(xì)胞將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸、脂肪酸衍生和/或TAG的有利表型。在一些實施方案中，有利表型是改變的脂肪酸譜、改變的三酰甘油譜、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率、細(xì)胞中增加的三酰甘油積累和增強(qiáng)的對滲透壓的耐受、增加的增殖速率、增加的細(xì)胞體積和/或細(xì)胞對濃度為致死和/或抑制其相同類型細(xì)胞的未經(jīng)修飾細(xì)胞之增殖的物質(zhì)增強(qiáng)的耐受。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的改變的脂肪酸譜或改變的三酰甘油譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少2倍。在一些實施方案中，與相同細(xì)胞類型的未經(jīng)修飾細(xì)胞相比，細(xì)胞的改變的脂肪酸譜或改變的三酰甘油譜表現(xiàn)出C18脂肪酸與C16脂肪酸的比率增加為至少2.5倍。在一些實施方案中，與相同細(xì)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.03.02 US 61/309,7821.分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其包含提高SCD表達(dá)的重組硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)基因和/或提高SCD表達(dá)的，相對于相同類型未修飾細(xì)胞的，至少一個額外的SCD基因拷貝，和降低Δ-12去飽和酶表達(dá)的遺傳修飾。2.權(quán)利要求1所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中降低Δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物表達(dá)的遺傳修飾為用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，所述核酸構(gòu)建體包含：(a)包含合適的同源或異源啟動子的表達(dá)盒，(b)包含編碼靶向Δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物之干擾RNA的核酸的表達(dá)盒，和/或(c)在插入所述細(xì)胞的基因組時降低Δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物的表達(dá)水平的核酸序列。3.權(quán)利要求1所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中：所述細(xì)胞包含重組硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)基因；所述重組SCD基因包含所述細(xì)胞基因組中的內(nèi)源核苷酸序列；所述內(nèi)源核苷酸序列編碼所述細(xì)胞內(nèi)源的SCD蛋白；所述重組SCD基因是重組的是因為所述內(nèi)源核苷酸序列已通過誘變或者通過重組事件被改變；并且所述誘變或重組事件提高了天然SCD蛋白的表達(dá)。4.權(quán)利要求2所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體抑制或消除所述Δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物的表達(dá)。5.權(quán)利要求4所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中通過缺失、破壞、突變和/或替換天然Δ-12去飽和酶基因的編碼序列或調(diào)節(jié)天然Δ-12去飽和酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一部分來介導(dǎo)對Δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物表達(dá)的抑制或消除。6.權(quán)利要求2、4或5所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中所述核酸構(gòu)建體插入所述細(xì)胞的基因組中。7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中SCD表達(dá)的提高賦予所述細(xì)胞將碳水化合物源轉(zhuǎn)化為脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油(TAG)的有利表型。8.權(quán)利要求1至7中任一項所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是產(chǎn)油酵母細(xì)胞。9.權(quán)利要求8所述的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)細(xì)胞。10.培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求1至9中任一項所述的產(chǎn)油真菌細(xì)胞。11.權(quán)利要求10的培養(yǎng)物，其還包含碳水化合物源。12.權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是可發(fā)酵糖。13.權(quán)利要求11或12所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是單糖。14.權(quán)利要求11或12所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源是葡萄糖和/或甘油。15.權(quán)利要求11至14中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源未滅菌。16.權(quán)利要求11至15中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物保持在未滅菌條件下。17.權(quán)利要求11至16中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物不包含對所述產(chǎn)油真菌細(xì)胞有選擇性的抗生素或抗增殖劑。18.權(quán)利要求11至17中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源來自植物或藻類生物質(zhì)。19.權(quán)利要求11至18中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述碳水化合物源來自纖維素、半纖維素、淀粉或甘油。20.權(quán)利要求18或19所述的培養(yǎng)物，其還包含纖維素水解酶或半纖維素水解酶。21.權(quán)利要求18至20中任一項所述的培養(yǎng)物，其中所述生物質(zhì)或所述纖維素或半纖維素在熱水或稀酸或氨纖維膨脹處理中預(yù)處理，用水解酶預(yù)處理，通過蒸汽預(yù)處理和/或石灰預(yù)處理。22.一種用于生產(chǎn)脂肪酸或三酰甘油的方法，其包括使碳水化合物源與權(quán)利要求1-9中任一項的分離的產(chǎn)油真菌細(xì)胞接觸；和在適于由所述細(xì)胞至少部分地將所述碳水...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：格里戈里·斯特凡諾普洛斯，賽義德·侯賽因·伊馬姆·阿比迪，
申請(專利權(quán))人：麻省理工學(xué)院，
類型：
國別省市：