支鏈脂肪酸以及其生物性生產制造技術

本發明專利技術提供了生產反異脂肪酸的方法。所述方法包括在允許一種或更多種多核苷酸的表達和反異脂肪酸的生產的條件下培養細胞，所述細胞包含至少一種外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的至少一種：丙酮酸至檸蘋酸的轉化；檸蘋酸至檸康酸的轉化；檸康酸至β-甲基-D-蘋果酸的轉化；β-甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉化；或蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉化。任選地，所述細胞還包含至少一種外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列：所述多肽催化下列反應：2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉化、2-乙酰-2-羥丁酸至2,3-二羥基-3-甲基戊酸的轉化、和/或2,3-二羥基-3-甲基戊酸至α-酮基-3-甲基戊酸的轉化。本發明專利技術也提供了生產反異脂肪酸的細胞以及使用所述細胞生產反異脂肪酸的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及生產脂肪酸的細胞和方法，更具體地講涉及生產反異和/或異支鏈脂肪酸的細胞和方法。
技術介紹
反異和異支鏈脂肪酸是具有分別在n-2和η-l碳上具有甲基支鏈的羧酸。類似于其他脂肪酸，反異和異支鏈脂肪酸用于制造例如食品、洗滌劑、殺蟲劑和個人護理產品如洗發劑、皂和化妝品。反異和異支鏈脂肪酸能夠通過化學合成或能夠從某些動物和細菌中分離。雖然某些細菌例如大腸桿菌非天然生產反異或異支鏈脂肪酸，但一些細菌如芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬的成員天然生產反異和異支鏈脂肪酸。例如，除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)都生產具有15個和17個總碳的反異脂肪酸和具有15個、16個和17個總碳的異支鏈脂肪酸(Cropp等人,Can.J.Microbiology 46:506-14(2000)；De Mendoza等人，Biosynthesis and Function of Membrane Lipids, in Bacillussubtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonenshein 和 Losick 編輯，AmericanSociety for Microbiology, (1993))。然而,這些生物體不生產商業可用量的反異和/或異支鏈脂肪酸。這些天然生物體的另一限制是它們似乎不生產中鏈反異和/或異支鏈脂肪酸如具有11個或13個碳的那些。同樣地，需要商業可用的生物合成生產的反異和/或異支鏈脂肪酸。此外，需要生產此類反異和/或異支鏈脂肪酸的方法。 專利技術概述提供了生產反異和/或異支鏈脂肪酸(本文也稱為反異和/或異脂肪酸)的細胞和方法。多核苷酸包含編碼催化與細胞中支鏈脂肪酸生產相關聯的反應的多肽的核酸序列。在一個方面，本專利技術提供生產反異脂肪酸的方法。所述方法包括在允許一種或更多種多核苷酸的表達和反異脂肪酸的生產的條件下培養細胞，所述細胞包含至少一種外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的至少一種:(aa)丙酮酸至檸蘋酸的轉化；(bb)檸蘋酸至檸康酸的轉化；(cc)檸康酸至β -甲基-D-蘋果酸的轉化；(dd) β -甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉化；或(ee)蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉化。所述細胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細胞生產更多的反異脂肪酸。在一些實施方案中，所述細胞還包含至少一種外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的至少一種:(ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉化，(gg) 2-乙酰-2-羥丁酸至2，3- 二羥基-3-甲基戊酸的轉化，或(hh) 2，3- 二羥基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的轉化。任選地，所述方法還包括從培養物中提取反異脂肪酸或從培養物中提取來源于反異脂肪酸的產物。本專利技術也提供細胞，所述細胞包含下列多核苷酸:包含編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼支鏈α -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述細胞中表達。此外，本專利技術提供細胞，所述細胞包含下列多核苷酸:包含編碼朽1蘋酸合酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼支鏈a -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述細胞中表達。任選地，所述細胞還包含下列多核苷酸:包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸和/或包含編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸。本專利技術也提供了通過培養細胞生產反異脂肪酸的方法。在某些實施方案中，提供了具有至少一種外來的多核苷酸的細胞。作為另外一種選擇或除此之外，所述細胞包含過表達的多核苷酸。所述多核苷酸具有編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的一種:異亮氨酸至2-酮基，3-甲基戊酸的轉化；2-酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的轉化；2_甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的轉化；2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉化；或?；?ACP至反異脂肪酸的轉化。包含外來的多核苷酸的細胞比不包含所述外來的多核苷酸的其它類似的細胞生產更多的反異脂肪酸。本專利技術也提供了提高細菌細胞中反異脂肪酸的方法。所述方法包括在細菌細胞中表達編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反應中的一種:2_酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的轉化；2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的轉化；2_甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉化；或?；?ACP至反異脂肪酸的轉化，以及在允許細胞生產多肽的條件下培養所述細菌細胞使得反異脂肪酸生產。本專利技術還提供了生產反異脂肪酸的大腸桿菌細胞。 還提供了提高細胞中反異脂肪酸的方法。所述方法包括在細胞中表達多核苷酸，所述多核苷酸編碼外來的支鏈氨基酸氨基轉移酶、外來的支鏈a -酮酸脫氫酶(BCDH)和外來的3-酮脂酰-ACP合酶；以及在使得反異脂肪酸生產的條件下培養所述細胞。在某些實施方案中，提供了生產反異脂肪酸的方法。所述方法包括培養包含至少一種外來的多核苷酸的至少一種細胞，所述多核苷酸編碼至少一種多肽，其能夠在使得反異脂肪酸生產的條件下從異亮氨酸中生產反異脂肪酸。此外，在某些實施方案中，還提供了包含至少兩種外來的多核苷酸的細胞。所述外來的多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的至少兩種:亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的轉化；纈氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的轉化；2_酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的轉化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的轉化；3_甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己酰基-ACP的轉化；2_酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的轉化；2-甲基丙酰-Cok至2-甲基丙酰-ACP的轉化；2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的轉化；3_甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的轉化；2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的轉化；或酰基-ACP至異脂肪酸的轉化，并且其中包含所述外來的多核苷酸的細胞比不包含所述外來的多核苷酸的其它類似的細胞生產更多的異脂肪酸。還提供了提高細菌細胞中異脂肪酸的方法。所述方法包括在細菌細胞中表達編碼至少兩種多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反應中的至少兩種:亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的轉化；纈氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的轉化；2_酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的轉化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的轉化；3_甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉化；2_酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的轉化；2_甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的轉化；2_甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的轉化；3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.12.22 US 61/289,039;2010.12.20 US 12/972,8221.一種生產反異脂肪酸的方法，所述方法包括在允許一種或更多種多核苷酸的表達和反異脂肪酸的生產的條件下培養細胞，所述細胞包含至少一種外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的至少一種: (aa)丙酮酸至檸蘋酸的轉化； (bb)檸蘋酸至檸康酸的轉化； (Ce)朽1康酸至β -甲基-D-蘋果酸的轉化； (dd) β -甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉化；或 (ee)蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉化 其中所述細胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細胞生產更多的反異脂肪酸。2.按權利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述細胞暴露于硫胺素。3.按權利要求1所述的方法，所述方法還包括從培養物中提取反異脂肪酸。4.按權利要求1所述的方法，所述方法還包括從所述培養物中提取來源于反異脂肪酸的產物。5.按權利要求1所述的方法，其中所述細胞還包含至少一種外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應中的至少一種: (ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉化， (gg) 2-乙酰-2-羥丁酸至2，3- 二羥基-3-甲基戊酸的轉化，或 (hh) 2，3- 二羥基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的轉化。6.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞包含外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化3、4、5、6、7或全部反應的多肽。7.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞包含外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化反應(aa)、(bb)、(cc)和(ff)的多肽。8.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞包含下列多核苷酸:編碼檸蘋酸合酶的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸異構酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、或它們的組合。9.按權利要求8所述的方法，其中所述細胞包含下列多核苷酸:編碼檸蘋酸合酶的外來的多核苷酸、編碼乙酰羥酸合酶的外來的或過表達的多核苷酸、編碼異丙基蘋果酸異構酶的外來的或過表達的多核苷酸和編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的外來的或過表達的多核苷酸。10.按權利要求8所述的方法，其中所述檸蘋酸合酶是來源于詹氏甲烷球菌CimA。11.按權利要求8所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸異構酶是大腸桿菌LeuCD。12.按權利要求8所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸脫氫酶是大腸桿菌LeuB。13.按權利要求8所述的方法，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。14.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞包含外來的或過表達的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化反應(ee)和(ff)的多肽。15.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞包含下列多核苷酸:編碼蘇氨酸脫氨酶的外來的或過表達的多核苷酸和編碼乙酰羥酸合酶的外來的或過表達的多核苷酸。16.按權利要求15所述的方法，其中所述蘇氨酸脫氨酶是大腸桿菌TdcB。17.權利要求15所述的方法，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。18.按權利要求5所述的方法,其中所述一種或更多種外來的或過表達的多核苷酸 (i)包含核酸序列，所述核酸序列與如SEQID N0:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少約90%的同一性，或 (ii)編碼多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與如SEQID N0:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84或85所示的氨基酸序列具有至少約90%的同一性。19.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞經修飾以降低支鏈氨基酸氨基轉移酶的活性。20.按權利要求5所述的方法，其中所述細胞還包含下列多核苷酸:包含編碼支鏈氨基酸氨基轉移酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼支鏈α -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸、包含編碼?；D移酶的核酸序列的外來的或過表達的多核苷酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：C·W·桑德斯，徐雋，P·R·格林，D·B·庫蒂，Z·S·坎巴塔，
申請(專利權)人：寶潔公司，
類型：
國別省市：