一種模擬重組無(wú)痕克隆方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種模擬重組無(wú)痕克隆方法，所述方法是設(shè)計(jì)載體引物時(shí)，在引物的5’末端要分別增加與目的基因序列相同的一段DNA堿基，所得載體DNA末端和目的基因內(nèi)部具有匹配區(qū)域，再將載體DNA和目的基因混合，先后用λ?Exonuclease和T4?DNA聚合酶處理，獲得重組DNA。本發(fā)明專利技術(shù)的有益效果主要體現(xiàn)在：（1）不需要經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因，減少了PCR引起的突變；（2）可以從DNA混合物中特異性地克隆目的片段；（3）不留酶切位點(diǎn)的痕跡。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及。
技術(shù)介紹
利用引物5’末端加酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增目的基因片段，酶切后再連接入特定載體中，已成為經(jīng)典的克隆方法。這種方法也存在著一些問(wèn)題:當(dāng)載體上的酶切位點(diǎn)與目的基因片段有沖突時(shí)，往往要改造載體；當(dāng)目的基因GC含量高或具有穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，我們常常難以獲得足量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；此外，當(dāng)目的基因片段很長(zhǎng)時(shí)，容易導(dǎo)致擴(kuò)增效率低、突變率高的問(wèn)題。Fu J.等人(2012)專利技術(shù)了一種利用全長(zhǎng)RecE、RecT、Redy及RecA等重組酶在大腸桿菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)大片段DNA間進(jìn)行重組的方法(Fu J,Bian X, Hu S，Wang H, Huang F，Seibert PM, Plaza A, Xia L, Miiller R, StewartAF, Zhang Y.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombinationand facilitates direct cloning for bioprospecting.Nat Biotechnol.2012May ;30(5):440-6.)，然而這種方法所依賴重組酶同時(shí)具有使目的基因內(nèi)部產(chǎn)生非特異性重組的風(fēng)險(xiǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的是提供一種用λ Exonuclease和Τ4 DNA聚合酶體外模擬大腸桿菌體內(nèi)重組的方法。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是:，所述方法包括:( I)載體DNA制備:以克隆載體質(zhì)粒為模板，按常規(guī)方法以目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列為結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，然后在引物5’端分別加上與目的基因匹配的長(zhǎng)度為20 30bp (優(yōu)選25bp)的序列，最終所得上游引物記為primerl,下游引物記為primer2,以primerl和primer2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得載體DNA ；(2)目的基因制備:按常規(guī)方法進(jìn)行酶切獲得包含目的基因的片段；或者按常規(guī)方法針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，所得引物以含有目的基因的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到包含目的基因的片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合，先加入入Exonuclease, 37°C反應(yīng) 30 min，72°C溫浴 5min , 50°C溫浴 30min,然后溫度降至 37°C,力口入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應(yīng)15 min，獲得重組DNA。 本專利技術(shù)原理參見(jiàn)圖1。λ Exonuclease (Lambda exonuclease)具有依賴于5’憐酸基團(tuán)的5’一 3’外切核酸酶活性，T4 DNA聚合酶具有3’一 5’外切核酸酶活性及5’一 3’聚合酶活性。如圖1C所不,利用T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)憐酸化DNA,使λExonuclease對(duì)雙鏈DNA的末端起外切核酸酶的作用而形成單鏈區(qū),若載體末端和目的基因內(nèi)部具有匹配區(qū)域(overlap,圖1中分別用EZZ3和KSSS表示)，單鏈區(qū)域就能夠根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則特異性退火。退火后的產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA聚合酶的3’一 5’外切核酸酶活性及5’ 一 3’聚合酶活性作用后，形成具有切刻(Nick)的環(huán)狀雙鏈DNA。轉(zhuǎn)化入細(xì)菌后，就能完成目的基因到目的載體的克隆。利用這種方法克隆目的基因時(shí)，目的基因的兩端可以有多余的DNA序列(圖1A)。這種方法要求設(shè)計(jì)載體引物時(shí)，在引物的5’末端要分別增加與目的基因序列相同的一段DNA堿基(圖1B)，該序列相同區(qū)域不必對(duì)應(yīng)于目的基因的末端(圖1中分別用wm和表示)。以Lambda DNA中4kb的目的片段為例，具體的，所述方法如下:(I)載體DNA制備:以克隆載體pBlueScript II KS (_)質(zhì)粒為模板，以引物MR4kbPl和MR4kbP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到載體DNA ；引物MR4kbPl序列如下:5’ -GCATAGGCGGGTTCAAGCATCAGCGATCGAATTCCTGCAGCC-3’ ；引物MR4kbP2序列如下:5’ -CTGGGCTATGCGCTGCAGCATCAACATCAAGCTTATCGATACCG-3’ ；(2)目的基因制備:以Lambda DNA為模板，用引物MR4kbPF和MR4kbPR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因； 引物MR4kbPF 序列如下:5’ - AGGAGGAGAAGAGTGACAGCA -3’ ；引物MR4kbPR 序列如下:5’ - GTCATGCTTCTCCAGTGCATC -3’ ；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合，先加入入Exonuclease, 37°C反應(yīng) 30 min，72°C溫浴 5min , 50°C溫浴 30min,然后溫度降至 37°C,力口入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應(yīng)15 min，獲得重組DNA。具體的，所述目的基因?yàn)镾oxlO基因的編碼區(qū)(0RF)，所述方法如下: (I)載體DNA制備:以pGEX-4T-l載體質(zhì)粒為模板，以引物SoxlO-pGEX-Pl和SoxlO-pGEX-P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到載體DNA ；弓丨物SoxlO-pGEX-Pl序列如下:5’ - AGGTCTTGTTCCTCGGCCATGAATTCCGGGGATCCACGC -3’ ；引物SoxlO-pGEX_P2 序列如下:5’ - CGACTCTATCCCGACCTTAGCTCGAGCGGCCGCATCGTG -3’ ；(2)目的基因制備:包含SoxlO ORF的pBlueScript II KS(_)質(zhì)粒用內(nèi)切酶EcoR1-HF和XhoI進(jìn)行酶切(37°C，4h)，獲得SoxlO ORF酶切片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合，先加入入Exonuclease, 37°C反應(yīng) 30 min，72°C溫浴 5min , 50°C溫浴 30min,然后溫度降至 37°C,力口入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應(yīng)15 min，獲得重組DNA。本專利技術(shù)的有益效果主要體現(xiàn)在:(1)不需要經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因，減少了 PCR引起的突變；(2)可以從DNA混合物中特異性地克隆目的片段；(3)不留酶切位點(diǎn)的痕跡。附圖說(shuō)明圖1為本專利技術(shù)原理和流程圖；圖2為L(zhǎng)ambda DNA的一段Alu I酶切序列；克隆位點(diǎn)距離各自的最近末端均為約400 bp,分別用EZ3和ISSS表示。圖3為插入片段檢測(cè)結(jié)果；泳道1-7為7個(gè)隨機(jī)挑選的白色菌落用PCR檢測(cè)插入片段，其中泳道3、5和6所代表的細(xì)菌克隆經(jīng)測(cè)序鑒定為含目的DNA片段的克隆；M，IOkbmarker。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:1.1、檢測(cè)模擬重組無(wú)痕克隆的效率。首先利用模擬重組無(wú)痕克隆方法從Lambda DNA的144個(gè)Alu I酶切片段中克隆一段(圖2)來(lái)檢測(cè)效率。1.1.1、目的DNA片段的制備。在40 μ I IXNEB Buffer (New England Biolabs)中，將 2yg Lambda DNA(Sangon)用 20U 的 AluI 內(nèi)切酶(New England Biolabs)在本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種模擬重組無(wú)痕克隆方法，所述方法包括：（1）載體DNA制備：以克隆載體質(zhì)粒為模板，以目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列為結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并在引物5’端分別加上與目的基因匹配的長(zhǎng)度為20~30bp的序列，所得上游引物記為primer1，下游引物記為primer2，以primer1和primer2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得載體DNA；?（2）目的基因制備：經(jīng)酶切或擴(kuò)增獲得包含目的基因的片段；（3）基因重組：將步驟（1）載體DNA和步驟（2）所得片段混合，先加入λ?Exonuclease，37℃反應(yīng)30?min?，72℃溫浴5min?，50℃溫浴30min，然后溫度降至37℃，加入?T4?DNA聚合酶和dNTPs，37℃反應(yīng)15?min，獲得重組DNA。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種模擬重組無(wú)痕克隆方法，所述方法包括:(1)載體DNA制備:以克隆載體質(zhì)粒為模板，以目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列為結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并在引物5’端分別加上與目的基因匹配的長(zhǎng)度為2(T30bp的序列，所得上游引物記為primerl,下游引物記為primer2,以primerl和primer2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得載體DNA ；(2)目的基因制備:經(jīng)酶切或擴(kuò)增獲得包含目的基因的片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合,先加入λExonuclease,37°C反應(yīng)30 min，72°C溫浴5min，50°C溫浴30min，然后溫度降至37°C，加入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應(yīng)15 min，獲得重組DNA。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因?yàn)镾oxlO基因的編碼區(qū)，所述方法如下:(1)載體DNA制備:以pGEX-4T-l載體質(zhì)粒為模板，以...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴忠敏，齊瀛川，孫淑慧，邱猛生，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：杭州師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：