本發明專利技術公開了一種成熟人β防御素-2及其制備方法，該方法是將谷氨酸殘基引入人β防御素-2的成熟序列和前肽之間，通過重組表達得到人β防御素-2前原肽，經鎳柱親和層析純化得到較高純度的人β防御素-2前原肽，然后用帶His-tag的重組地衣芽孢桿菌谷氨酸特異性內肽酶進行酶解處理，將前肽及親和標簽切除，并再次通過親和層析去除重組地衣芽孢桿菌谷氨酸特異性內肽酶和其他雜質，純度較高的成熟人β防御素-2存在于穿過液中。本發明專利技術所述的成熟HBD-2制備方法具有高效、安全無毒性、成本低和純化工藝簡單的優點，從而為成熟HBD-2的大規模制備及其應用奠定基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程領域的基因重組表達
，具體涉及一種成熟人β防御素-2的新型制備方法。
技術介紹
人β防御素(HBD)是一種富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌甚至病毒都有較強的殺滅作用，因此在食品、化妝品和防腐等領域有著廣泛的應用。人β防御素-2 (HBD-2)于1997年在銀屑病皮損組織中發現(J.Harder，J.Bartels,E.Christophers,J.Schroder,A peptide antibiotic from human skin.Nature, 1997，(387):861-861 )，是HBD家族成員之一，其陽離子區可以與細菌細胞膜的陰離子磷脂頭部基因及水分子相互作用，形成靜電力，在膜上形成電壓依賴性孔道，然后插入膜中形成多聚體形成更大的孔道，從而破壞靶細胞DNA，最終導致細胞溶解(D.M.Hoover, K.R.Rajashankarj R.Blumenthalj A.Puri, J.J.0ppenheimj 0.Chertovj J.Lubkowskij The structure of human β -defensin-2shows evidence of higher orderoligomerization.Journal of Biological Chemistry, 2000, (275):32911-32918)。有研究報道人防御素對腫瘤細胞的毒性比對非腫瘤細胞的毒性要強2-50倍，而且人防御素還能顯著地提高阿霉素對耐多藥腫瘤細胞的裂解作用(S.Johnstone, K.Gelmonj L.Mayer, R.HankcockjM.Bally, Peptide-mediated cytotoxicity and peptide-enhancedcytoxic activity of doxorubicin against wild—type and p-glycoproteinover-expressing tumor cell lines, Ant1-Cancer Drug Design，2000，(15):151-160)，且人β防御素-2在低濃度下能趨化樹突狀細胞(DC)和記性性T細胞朝著受致病微生物侵襲的病灶部位迀移，能提高人體的免疫機能(Yang D，Chertov 0，Bykovskaia S N，etal.Beta-defensiss: linking innate and adaptive immunity through dendritic and Tcell CCR6[J].Science，1999，(287):525-552，因此 HBD-2 還有應用于腫瘤治療的前景。基于HBD-2的廣泛應 用前景，HBD-2在大腸桿菌細胞(X.Fang，L.Peng，Z.Xu，J.Wuj P.Cenj Cloning and expression of human beta-defensin_2gene in Eseherichiacol1.Protein andpeptide letters, 2002，9 (I): 31-37 )和大腸桿菌無細胞表達體系Φ (H.Chen, Z.Xuj N.Xuj P.Cenj Efficient production ofa soluble fusion proteincontaining human beta—defensin_2in E.coli cell-free system.Journal ofbiotechnology，2005，(115): 307-315)均得到了表達，Fang 等(X.Fang，L Peng，Ζ.Xu，J.Wuj P.Cenj Cloning and expression of human beta-defensin_2gene in Eseherichiacol1.Protein andpeptide letters, 2002，9(1):31-37)在成熟 HBD-2 序列前融合其他分子量較大的蛋白(如硫氧還蛋白)，并在兩者之間引入腸激酶識別位點，所得蛋白用腸激酶進行處理從而得到成熟HBD-2，以陽離子交換層析對成熟HBD-2進行純化；Wang 等(F.Wang，X.Fang，Zhinan Xuj L.Peng,P.Cenj Fusion Expression of HumanBeta-Defensin-2from Multiple Joined Genes in Escherichia coli,PreparativeBiochemistry and Biotechnology, 2003 (34): 215-225)在大腸桿菌中以串聯形式表達HBD-2前原肽多聚體，并在成熟序列前引入甲硫氨酸，用溴化氰裂解法除去其前肽，得到成熟的HBD-2。盡管在無細胞表達體系中HBD-2的產量及純度都較高，但其制備成本太高，不適合大規模制備；用腸激酶處理去除HBD-2的前肽，處理時間相對較長，一般需要8-16h，切割效率相對低下，而且腸激酶還存在一定程度的非特異性切割(S.H.Shahravan, X.Qu, 1.S.Chan, J.A.Shin, Enhancing the specificity of the enterokinase cleavagereaction to promote efficient cleavage of a fusion tag.Protein Expression andPurification59, 2008, 314-319);且通過離子交換層析除去HBD-2前肽和腸激酶，無法保證成熟HBD-2的純度；使用溴化氰裂解法除去HBD-2前肽，有較強的毒性，對實驗人員健康不利，且不利于后期的應用，還存在一定的非特異性切割。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種能簡單高效地獲得的較高純度的成熟HBD-2，同時提供制備上述成熟HBD-2的方法，并使其能大規模應用。本專利技術的目的通過以下技術方案實現:一種成熟人β防御素-2的制備方法，包括如下步驟:( I)人β防御素-2前原肽重組表達載體的制備:a.以SEQ ID NO: 1-2的核苷酸序列為上、下游引物，以HBD-2前原肽序列為模板，進行PCR擴增，獲得重組HBD-2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6標簽，在其C端引入終止子；所述模板是將谷氨酸殘基引入HBD-2全長序列(該全長序列為密碼優化過的序列，GenBank ID:AY155 577)，通過全合成獲得重組HBD-2前原肽序列，其核苷酸序列為SEQID NO:3 ；b.步驟a所得產物用NdeI和XhoI進行雙酶切，然后與NdeI和XhoI雙酶切的表達載體pET22b(+)連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞；C.從步驟b中感受態細胞中提取質粒進行雙酶切及測序鑒定，所得陽性克隆轉化至大腸桿菌DH5 α感受態細胞中進行表達，得到HBD-2重組表達載體；(2)重組HBD-2前原肽的制備a.工程菌誘導表達將步驟(I)所得HBD-2重組表達載體接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于37°C振搖過夜本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種成熟人β防御素?2的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）人β防御素?2前原肽重組表達載體的制備a．以SEQ?ID?NO:1?2的核苷酸序列為上、下游引物，以HBD?2前原肽序列為模板，進行PCR擴增，獲得重組HBD?2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6標簽，在其C端引入終止子；所述模板的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:3；b．步驟a所得產物用NdeI和XhoI進行雙酶切，然后與NdeI和XhoI雙酶切的表達載體pET22b連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；c．從步驟b中感受態細胞中提取質粒進行雙酶切及測序鑒定，所得陽性克隆轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行表達，得到HBD?2重組表達載體；（2）重組HBD?2前原肽的制備a．工程菌誘導表達將步驟（1）所得HBD?2重組表達載體接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于37℃振搖過夜，然后按1：50的體積比接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養基中，于OD=0.4?0.8時加入IPTG至終濃度為0.8mM，繼續培養4h后收集菌液，離心，去除上清液，細菌沉淀用TE緩沖液洗滌2次后，用細菌裂解液重懸，于冰浴下超聲，取超聲后的勻漿物離心，收集上清液；b．表達產物的純化取步驟a收集的上清液，以Ni2+?NTA樹脂親和層析法進行純化，即得到重組HBD?2前原肽；（3）成熟HBD?2的制備a．重組HBD?2前原肽的酶處理取步驟（2）所得重組HBD?2前原肽，在20mM、pH8.5的Tris?HCl中透析12h，加入1%w/w的重組地衣芽孢桿菌谷氨酸特異性內肽酶，于37℃處理1h后立即置于0℃冰浴中以終止反應；b．成熟HBD?2的獲得將步驟a酶處理過的HBD?2前原肽酶解液上樣至Ni2+?NTA樹脂親和層析柱，收集穿過液，成熟的HBD?2即存在于所得穿過液中。...
【技術特征摘要】
1.一種成熟人β防御素-2的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)人β防御素-2前原肽重組表達載體的制備 a.以SEQID NO: 1-2的核苷酸序列為上、下游引物，以HBD-2前原肽序列為模板，進行PCR擴增，獲得重組HBD-2前原肽目的基因序列，在其N端融合His6標簽，在其C端引入終止子；所述模板的核苷酸序列為SEQ ID NO:3 ； b.步驟a所得產物用NdeI和XhoI進行雙酶切，然后與NdeI和XhoI雙酶切的表達載體pET22b連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞； c.從步驟b中感受態細胞中提取質粒進行雙酶切及測序鑒定，所得陽性克隆轉化至大腸桿菌DH5 α感受態細胞中進行表達，得到HBD-2重組表達載體； (2)重組HBD-2前原肽的制備 a.工程菌誘導表達 將步驟(I)所得HBD-2重組表達載體接種于含氨芐青霉素的液體LB培養基中，于37°C振搖過夜，然后按1:50的體積比接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養基中，于OD=0.4-0.8...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王菊芳，葉偉，王海鷹，馬毅，于平儒，王小寧，
申請(專利權)人：華南理工大學，
類型：發明
國別省市：
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