自刪除質粒制造技術

提供了制備無選擇標記基因的質粒的方法，包括在不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組的宿主細胞環境中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，隨后在能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組的另一宿主細胞環境中培養所述質粒，從而去除所述選擇標記基因。還提供了通過所述方法制備的質粒在制備用于治療和疫苗目的的重組蛋白、制備治療性DNA和DNA疫苗以及使用活細菌載體向患者遞送重組蛋白和DNA中的用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法。具體而言，本專利技術涉及在一定條件下培養含有選擇標記基因的質粒的方法，所述條件允許根據選擇標記基因的表達進行選擇和選擇標記基因的隨后去除。本專利技術還涉及通過本方法制備的質粒在制備用于治療和疫苗目的的重組蛋白、制備治療性DNA和DNA疫苗、以及使用活細菌載體向患者遞送重組蛋白和DNA中的用途。通過引用將本文涉及的所有文件并入本文。
技術介紹
·質粒是自我復制的DNA分子，其天然存在于細菌、古生菌和一些單細胞真核生物，例如酵母。近年來，質粒在生物技術產業中必不可少，可用于表達重組蛋白基因以及作為DNA治療劑和疫苗。對于這些應用，通常修飾編碼感興趣基因的質粒，并使其在細菌宿主細胞中復制，例如大腸桿菌(Escherichia coli)。質粒通常編碼抗生素抗性基因,從而能夠實現抗生素選擇，抗生素選擇是用于鑒定轉化后含有質粒的細胞，其中向生長培養基中加入的選擇性抗生素能夠殺死丟失質粒的細胞。然而，使用抗生素進行質粒選擇和維持有多種弊端。第一，抗生素抗性基因在宿主細胞中的組成型表達對細胞產生代謝負擔，這會降低細胞活力并增加質粒丟失的頻率。第二，抗生素是生產過程中的額外的污染，發酵過程中的抗生素降解會降低選擇壓力。第三，對于DNA治療劑和疫苗，使用抗生素抗性基因會具有在環境中轉入病原體的危險，導致產生抗生素抗性病原株。當使用活細菌株作為向患者遞送基因的載體時，存在急性危險。因此，需要開發出不使用抗生素抗性基因的質粒選擇機制。已經發展出的備選技術需要表達的選擇標記基因，例如能補充宿主染色體中缺失的拷貝的必需基因的功能拷貝。胸苷酸合酶基因thyA (McNeil et al.2000, Appl.Environ.Microbiol., 66:1216-1219)或參與二氛基庚二酸合成的 asd 基因(Degryse 1991, Mol.Gen.Genet.227:49-51)已經被用作細胞中質粒的選擇基因，該細胞中的染色體基因是無功能的。該方法和抗生素選擇均有相同的重要缺點:選擇標記基因的存在和表達對細胞產生明顯的代謝負擔，并易于使質粒選擇性丟失(Bentley et al.1990, Biotechnol.Bioeng.35:668-681)。已經開發出了兩種更新的技術，其不需要選擇標記基因的表達，因此降低細胞的代謝負擔。ORT(操縱基因-阻遏蛋白滴定)利用修飾的細菌細胞，其中必需的染色體基因被置于誘導型啟動子的控制下。阻遏蛋白與鄰近啟動子的操縱基因序列結合，阻止必需基因的表達，從而在不存在誘導劑的情況下會導致細胞死亡。當用含有操縱基因序列的多拷貝質粒轉化ORT細菌細胞時，通過質粒滴定阻遏蛋白，并使必需基因表達，從而允許細胞生長并因此允許質粒選擇和維持(Cranenburgh et al.2001.Nucleic Acids Res.29:e26)。另一個無選擇標記基因的系統(oriSELECT)利用了 pMBl復制起點，在分子遺傳學研究和開發中使用的大多數質粒中均存在pMBl復制起點。pMBl ori天然產生用來調節其拷貝數的反義RNA，修飾oriSELECT細胞，使得該RNA與對應的有義序列的mRNA相互作用，有義序列被設計在與調節必需基因的的阻遏基因或毒素基因的基因融合體中，使得細胞存活需要質粒的存在(Cranenburgh 2005，W006/003412)。這些無選擇標記基因的表達系統的缺點在于，需要對微生物細胞的染色體進行遺傳修飾。這些修飾在許多物種中存在技術難度，甚至在易于接受遺傳操作的物種中，這些修飾耗時并且需要的工作量大。因此，仍需要開發出不含有選擇標記基因且不需要對宿主細胞進行遺傳修飾的質粒選擇系統。專利技術描述本申請的專利技術人開發出了制備無選擇標記基因的質粒的系統。在開發本系統時，本申請的專利技術人驚奇地發現，在無質粒維持系統的情況下，無選擇標記基因的質粒能夠在宿主細胞中維持。這個發現是意想不到的，因為在缺少質粒維持系統的情況下，本領域技術人員會預測質粒從宿主細胞中丟失。這個令人驚訝的發現可能是由于在去除選擇標記基因之后，細胞內發生的代謝負擔大幅降低。因此，第一方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括如下步驟:a)在第一宿主細胞環境中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，第一宿主細胞環境不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及b)隨后在第二宿主細胞環境中培養質粒，第二宿主細胞環境能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除選擇標記基因。宿主細胞環境 術語“宿主細胞環境”包括宿主細胞本身和宿主細胞環境的條件。因此，如果質粒被從第一宿主細胞轉移到第二宿主細胞或者如果宿主細胞的條件改變，則宿主細胞環境改變。在后一情況中，第一宿主細胞環境和第二宿主細胞環境是暫時分開的。通常，通過改變細胞培養的條件來改變宿主細胞中的條件。可以改變的條件包括但不限于滲透濃度、溫度、是否存在誘導劑、細胞生長期和能夠改變DNA的二級結構或超螺旋的化合物的存在。因此，第二方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括以下步驟:a)在第一宿主細胞中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，第一宿主細胞不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及b)隨后在第二宿主細胞中培養質粒，第二宿主細胞能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除選擇標記基因。第三方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括以下步驟:a)在一定滲透濃度下，在宿主細胞中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，在所述滲透濃度下不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及b)隨后改變宿主細胞的滲透濃度，從而能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除選擇標記基因。第四方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括以下步驟:a)在一定溫度下，在宿主細胞中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，在所述溫度下不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及b)隨后改變宿主細胞的溫度，從而能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除選擇標記基因。第五方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括以下步驟:a)在缺少誘導劑的條件下，在宿主細胞中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，在缺少誘導劑的條件下不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及b)隨后向宿主細胞添加誘導劑，從而能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除選擇標記基因。第六方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括以下步驟:a)在能改變質粒的DNA 二級結構或超螺旋的化合物的存在下，在宿主細胞中培養含有選擇標記基因的質粒，選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，所述化合物的存在使細胞不能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及b)隨后改變細胞內化合物的水平，從而能實現位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除選擇標記基因。第七方面，本專利技術涉及制備無選擇標記基因的質粒的方法，其包括以下步驟:a)在缺少能夠作用于位點特本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.06.30 GB 1011046.81.備無選擇標記基因的質粒的方法，所述方法包括以下步驟: a)在第一宿主細胞環境中培養含有選擇標記基因的質粒，所述選擇標記基因的側翼為位點特異性重組酶靶位點，所述第一宿主細胞環境不能實現所述位點特異性重組酶靶位點之間的重組；以及 b)隨后在第二宿主細胞環境中培養所述質粒，所述第二宿主細胞環境能夠實現所述位點特異性重組酶靶位點之間的重組，從而去除所述選擇標記基因。2.按權利要求1所述的方法，還包括以下步驟: c)在細胞培養中維持所述無選擇標記基因的質粒。3.按權利要求1或2所述的方法，還包括以下步驟: d)從所述第二宿主細胞環境分離所述無選擇標記基因的質粒。4.按權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述位點特異性重組酶靶位點與實現位點特異性重組所必需的附屬序列在功能上相關聯。5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一宿主細胞環境和所述第二宿主細胞環境在不同的細胞內。6.按權利要求5所述的方法，其中所述第一宿主細胞環境在編碼P印A、ArgR和ArcA的基因中的一個或多個中包含失活突變。7.按權利要求5或6所述的方法，其中所述第二宿主細胞環境包含ArgR或ArcA基因和PepA基因的活性形式。8.按權利要求5所述的方法，其中所述第二宿主細胞環境包含位點特異性重組酶。9.按權利要求7所述的方法，其中所述位點特異性重組酶是內源性位點特異性重組酶。10.按權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述第一宿主細胞環境和所述第二宿主細胞環境在相同的宿主細胞中形成。11.按權利要求9所述的方法，其中所述第一宿主細胞環境和所述第二宿主細胞環境是暫時分開的。12.按權利要求9或10所述的方法，其中所述第二宿主細胞環境包含誘導型位點特異性重組酶。13.按權利要求9-12中任一項所述的方法，其中通過改變所述細胞的溫度，改變所述細胞的滲透濃度，改變所述細胞中誘導劑的水平或改變所述細胞中能改變所述質粒的二級結構或超螺旋的化合物的水平來形成所述第二宿主細胞環境。14.按權利要求8、9、12或13中任一項所述的方法，其中所述位點特異性重組酶選自Cre, Flp, R、XerC, XerD, RipX 和 CodV。15.按權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述位點特異性重組酶靶位點是轉座酶靶位點。16.按權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述位點特異性重組酶靶位點選自Ecdif、cer、ps1、pif > mwr、Bsdif、loxP、FRT 和 RS017.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述選擇標記基因是抗生素抗性基因。18.按權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述選擇標記基因能允許產生在所述第一和/或第二宿主細胞環境中缺少，但又是所述第一和/或第二宿主細胞環境必需的代謝物。19.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一宿主細胞環境和/或所述第二宿主細胞環境是革蘭氏陰性細菌細胞。20.按權利要求19所述的方法，其中所述第一宿主細胞環境和所述第二宿主細胞環境獨立地選自埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、農桿菌屬(Agrobacterium)、假...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅基·馬爾科·科瑞安恩波格，馬修·威廉·萊肯拜，
申請(專利權)人：科步爾生物制劑有限公司，
類型：
國別省市：