具有粘度改變表型的絲狀真菌制造技術

本發明專利技術描述了與具有改變的生長特性的變異絲狀真菌相關的組合物和方法。此類變異株非常適于在深層培養物中生長，例如用于大規模生產供商業應用的酶和其他蛋白質。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術菌株和方法涉及絲狀真菌的基因突變，所述突變產生具有改變的生長特性的變異株。此類變異株非常適于在深層培養物中生長，如用于大規模生產供商業應用的酶和其他蛋白質或代謝物。參考文獻·以下參考文獻和本文引用的另外的參考文獻據此以引用方式并入:Caracuel, Z.etal.(2005) Molecular Plant-Microbe Interactionsl8:1140-47 (Caracuel，Z.等人，2005年，《植物-微生物分子相互作用》，第18卷，第1140-1147頁)。Hughes, H.and Stephens, D.J.(2008) Cell Biol.129:129-51 (Hughes, H.和Stephens, D.J.，2008年，《細胞生物學》，第129卷，第129-151頁)。Karhinen, L.etal.(2005) Traff ic6:562-74 (Karhinen, L.等人，2005 年，《通訊》，第6卷，第562-574頁)。Mouyna, 1.etal.(2005) Molecular Microbiology56: 1675-88 (Mouyna, 1.等人，2005年，《分子微生物學》，第56卷，第1675-1688頁)。Passolunghi, S.etal.(2010)Microbial Cell Factories9:7-17 (Passolunghi,S.等人，2010年，《微生物細胞工廠》，第9卷，第7-17頁)。Peng,R.etal.(2000) J.Biol.Chem.275:11521-28 (Peng, R.等人，2000 年，《生物化學雜志》，第275卷，第11521-11528頁)。Roberg, K.J.etal.(1999) J.Cell.Biol.145:659-72 (Roberg, K.J.等人，1999 年，《細胞生物學雜志》，第145卷，第659-672頁)。Shimoni, Y.etal.(2000) J.Cell.Biol.151:973-84 (Shimoni，Y.等人，2000 年，《細胞生物學雜志》，第151卷，第973-984頁)。Turchini, A.etal.(2000) J.Becteriol.182:1167-71 (Turchini, A.等人，2000年，《細菌學雜志》，第182卷，第1167-1171頁)。
技術介紹
絲狀真菌能夠高水平表達天然和異源蛋白質，因而非常適于大規模生產供工業應用的酶和其他蛋白質。絲狀真菌通常在生物反應器的菌絲深層培養物中生長，這些生物反應器適于將氧氣和營養物質引入培養基(即，培養液)并使氧氣和營養物質分布于其中。菌絲體的形態特征會影響培養液的流變性，從而影響生物反應器的性能。通常，培養液的粘度越高，氧氣和營養物質的分布越不均勻，攪拌培養物所需的能量也越多。在一些情況下，培養液的粘度變得十分高，顯著妨礙氧氣和營養物質的溶解，從而對真菌的生長產生不利影響。另外，混合粘稠培養液并且向粘稠培養液中通氣所需的能量會顯著增加生產成本,并且導致在電機和電源供應方面的資本支出更高。
技術實現思路
本專利技術描述了涉及絲狀真菌的菌株和方法，所述絲狀真菌具有可產生粘度改變表型的遺傳變更。在一個方面，提供衍自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，該變異菌株包含能使變異菌株的細胞與親本菌株的細胞相比產生改變量的功能性Sfb3蛋白的遺傳變更，其中變異菌株的細胞在深層培養有氧發酵過程產生這樣的細胞培養液，所述細胞培養液(i)與親本菌株的細胞相比，需要改變的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持改變的溶氧量。在一些實施方案中，功能性Sfb3蛋白的改變量為減少量，并且變異菌株在深層培養有氧發酵過程中產生這樣的細胞培養液，所述細胞培養液(i)與親本菌株的細胞相比，需要減少的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持增加的溶氧量。在一些實施方案中，遺傳變更包括親本菌株中存在的sfb3基因的破壞。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞是sfb3基因的全部或部分的缺失的結果。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞是包含sfb3基因的基因組DNA的一部分的缺失的結果。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞是sfb3基因的誘變的結果。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞使用位點特異性重組進行。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞是與在sfb3基因的遺傳基因座引入選擇性標記相結合進行。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞是將粘度降低表型賦予變異菌株的主要遺傳決定因子。 在一些實施方案中，變異菌株不產生功能性Sfb3蛋白。在一些實施方案中，變異菌株不產生Sfb3蛋白。在一些實施方案中，變異菌株還包含編碼目的蛋白的基因。在一些實施方案中，變異菌株每單位量生物質產生的蛋白質數量與親本菌株實質上相同。在一些實施方案中，變異菌株每單位量生物質產生的目的蛋白數量與親本菌株實質上相同。在一些實施方案中，Sfb3蛋白包含如下氨基酸序列:IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDffL (SEQ ID NO:9，其中X為任何氨基酸殘基)。在一些實施方案中，絲狀真菌是盤菌亞門(Pezizomycotina)的種。在一些實施方案中，絲狀真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。在另一個方面，提供產生絲狀真菌細胞變異菌株的方法，該方法包括:將遺傳變更引入絲狀真菌細胞親本菌株，其中與親本菌株的細胞相比，所述遺傳變更會改變功能性Sfb3蛋白的產生，從而產生出可在深層培養有氧發酵過程中產生這樣的細胞培養液的變異絲狀真菌細胞，所述細胞培養液(i)與親本菌株的細胞相比，需要改變的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持改變的溶氧量。在一些實施方案中，遺傳變更能減少或防止功能性Sfb3蛋白的產生，從而產生出可在深層培養有氧發酵過程中產生這樣的細胞培養液的變異絲狀真菌細胞，所述細胞培養液α)與親本菌株的細胞相比，需要減少的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或αυ與親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持增加的溶氧量。在一些實施方案中，遺傳變更包括使用遺傳操作來破壞親本絲狀真菌細胞中的sfb3基因。在一些實施方案中，遺傳變更包括使用遺傳操作使親本絲狀真菌細胞中的sfb3基因缺失。在一些實施方案中，遺傳變更使用位點特異性基因重組進行。在一些實施方案中，sfb3基因的破壞是與在sfb3基因的遺傳基因座引入選擇性標記相結合進行。在一些實施方案中，變異菌株的每單位量生物質可產生與親本菌株實質上相同量的蛋白。在一些實施方案中，變異菌株的每單位量生物質可產生與親本菌株實質上相同量的目的蛋白。 在一些實施方案中，sfb3蛋白包含如下氨基酸序列:IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDffL(SEQ ID NO:9，其中X為任何氨基酸殘基)。在一些實施方案中，絲狀真菌是盤菌亞門的種。在一些實施方案中，絲狀真菌是里氏木霉。在一些實施方案中，親本菌株還包含編碼目的蛋白的基因。在一些實施方案中本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.08.25 US 61/377,0301.種衍自親本菌株的絲狀真菌變異菌株，所述變異菌株包含能使所述變異菌株的細胞與所述親本菌株的細胞相比產生改變量的功能性Sfb3蛋白的遺傳變更，其中所述變異菌株的細胞在深層培養有氧發酵過程產生這樣的細胞培養液，所述細胞培養液(i)與所述親本菌株的細胞相比，需要改變的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持改變的溶氧量。2.據權利要求1所述的變異菌株，其中功能性Sfb3蛋白的所述改變量為減少量，并且所述變異菌株在深層培養有氧發酵過程中產生這樣的細胞培養液，所述細胞培養液(i)與所述親本菌株的細胞相比，需要減少的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持增加的溶氧量。3.據權利要求1或2所述的變異菌株，其中所述遺傳變更包括破壞所述親本菌株中存在的所述sfb3基因。4.據權利要求3所述的變異菌株，其中破壞所述sfb3基因是缺失所述sfb3基因的全部或部分所致。5.據權利要求3所述的變異菌株，其中破壞所述sfb3基因是缺失包含所述sfb3基因的基因組DNA的一部分所致。6.據任何權利要求3所述的變異菌株，其中破壞所述sfb3基因是誘變所述sfb3基因所致。7.據權利要求3至6中任一項所述的變異菌株，其中破壞所述sfb3基因是使用位點特異性重組來進行。8.據權利要求3至7中任一項所述的變異菌株，其中破壞所述sfb3基因是與在所述sfb3基因的遺傳基因座引入選擇性標記相結合來進行。9.據權利要求3至8中任一項所述的變異菌株，其中破壞所述sfb3基因是賦予所述變異菌株粘度降低表型的主要遺傳決定因子。10.據權利要求1至9中任一項所述的變異菌株，其中所述變異菌株不產生功能性Sfb3蛋白。11.據權利要求1至9中任一項所述的變異菌株，其中所述變異菌株不產生Sfb3蛋白。12.據權利要求1至11中任一項所述的變異菌株，其中所述變異菌株還包含編碼目的蛋白的基因。13.據權利要求1至12中任一項所述的變異菌株，其中所述變異菌株每單位量生物質產生的蛋白質數量與所述親本菌株實質上相同。14.據權利要求1至13中任一項所述的變異菌株，其中所述Sfb3蛋白包含氨基酸序列 IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO:9，其中 X 為任何氨基酸殘基)。15.據權利要求1至14中任一項所述的變異菌株，其中所述絲狀真菌是盤菌亞門的種。16.據權利要求1至15中任一項所述的變異菌株，其中所述絲狀真菌是里氏木霉。17.種產生絲狀真菌細胞變異菌株的方法，包括:將遺傳變更引入到絲狀真菌細胞親本菌株中，其中與所述親本菌株的細胞相比，所述遺傳變更會改變功能性Sfb3蛋白的產生，從而產生出可在深層培養有氧發酵過程中產生這樣的細胞培養液的變異絲狀真菌細胞，所述細胞培養液(i)與所述親本菌株的細胞相比，需要改變的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持改變的溶氧量。18.據權利要求17所述的方法，其中所述遺傳變更會減少或防止功能性Sfb3蛋白的產生，從而產生出可在深層培養有氧發酵過程中產生這樣的細胞培養液的變異絲狀真菌細胞，所述細胞培養液Q)與所述親本菌株的細胞相比，需要減少的攪拌量來保持預選的溶氧量，和/或(ii)與所述親本菌株的細胞相比，在預選的攪拌量下保持增加的溶氧量。19.據權利要求17或18所述的方法，其中所述遺傳變更包括使用遺傳操作在親本絲狀真菌細胞中破壞所述sfb3基因。20.據權利要求17或19所述的方法，其中所述遺傳變更包括使用遺傳操作在親本絲狀真菌細胞中缺失所述sfb3基因。21.據權利要求17至20中任一項所述的方法，其中所述遺傳變更是使用位點特異性基因重組來進行。22.據權利要求17至21中任一項所述的方法，其中破壞所述。sfb3基因是與在所述sfb3基因的遺傳基因座引入選擇性標記相結合來進行。23.據權利要求17至22中任一項所述的方法，其中所述變異菌株每單位量生物質產生的蛋白質數量與所述親本菌株實質上相同。24.據權利要求17至23中任一項所述的方法，其中所述Sfb3蛋白包含氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDffL(SEQ ID NO:9，其中 X 為任何...

【專利技術屬性】
技術研發人員：T·C·道奇，A·維拉格，M·華德，
申請(專利權)人：丹尼斯科美國公司，
類型：
國別省市：