表達(dá)巢蛋白的腎源干細(xì)胞或祖細(xì)胞制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種表達(dá)巢蛋白的腎源干細(xì)胞或祖細(xì)胞、分離該細(xì)胞的方法，以及該細(xì)胞的用途。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)所述的方法包括：提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；飼養(yǎng)小鼠至1周齡或以上，分離腎，用膠原酶IV和胰蛋白酶消化，過(guò)濾消化后的細(xì)胞懸液，篩除腎結(jié)締組織、腎小管和細(xì)胞團(tuán)塊，獲得單個(gè)細(xì)胞；通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的腎源干細(xì)胞或祖細(xì)胞。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了根據(jù)上述方法分離的腎源干/祖細(xì)胞，以及進(jìn)一步在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的自我更新和增殖的細(xì)胞，并且提供了將這些細(xì)胞用于制備治療腎損傷修復(fù)的組合物的用途。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于干細(xì)胞與組織工程領(lǐng)域，涉及一種表達(dá)巢蛋白(Nestin)的腎源干細(xì)胞或祖細(xì)胞(Nestin+RSPCs)、分離該腎源干/祖細(xì)胞的方法，以及該腎源干/祖細(xì)胞的用途。本專(zhuān)利技術(shù)特別涉及巢蛋白-綠色突光蛋白(Nestin-Green Fluorescent Protein,Nestin-GPF)轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)流式分選技術(shù)分離Nestin+腎源干/祖細(xì)胞(Nestin+RSPCs)，并驗(yàn)證其自我更新能力和增殖能力；隨后細(xì)胞移植到腎缺血損傷動(dòng)物模型體內(nèi)，鑒定Nestin+RSPCs在體內(nèi)的分化特性和損傷修復(fù)的功能。
技術(shù)介紹
腎源干細(xì)胞的研究起步較晚，對(duì)其生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)有很大局限性。近幾年研究報(bào)道了成體腎組織分離具有干/祖細(xì)胞潛能細(xì)胞的方法，但大多數(shù)屬于回顧性研究，分離得到的細(xì)胞很難鑒定是否真正的干細(xì)胞。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)腎小管(tubules)和腎乳頭間質(zhì)(interstitium of renalpapilla)中的一些低更新率(slow-cycling)的細(xì)胞,存在某些干/祖細(xì)胞特性(Hong KU,Reynolds SDj Giangreco A, et al. Clara cell secretory protein-expressing cellsof the airway neuroepithelial body microenvironment include a label-retainingsubset and are critical for epithelial renewal after progenitor cell depletion.Am J Respir Cell Mol Biol. 2001. 24: 671-681 )，但后來(lái)被證實(shí)它們只是具有某些干/ 袓細(xì)胞特性的已分化的細(xì)胞(Maeshima A, Yamashita S，Nojima Y. Identificationof renal progenitor-like tubular cells that participate in the regenerationprocesses of the kidney. J Am Soc Nephrol. 2003. 14: 3138-3146)。該類(lèi)細(xì)胞與腎其它不同更新速率細(xì)胞的分化程度沒(méi)有區(qū)別(Bruno S，Bussolati B，Grange C，et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells inhuman glomeruli. Stem Cells Dev. 2009. 18: 867-880)，并且成體分化了的上皮細(xì)胞(epithelial cell)也有形成克隆和自我更新的能力(Cicero SAj Johnson D，ReyntjensS， et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmentedciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2009. 106:6685-6690)。 ImaiN等在特定培養(yǎng)條件下獲的類(lèi)似干細(xì)胞的細(xì)胞，但該細(xì)胞卻不能修復(fù)缺血再灌注損傷的腎組織(Imai N，Hishikawa K，Marumo Tj et al. Inhibition of histone deacetylaseactivates side population cells in kidney and partially reverses chronic renalinjury. Stem Cells. 2007. 25: 2469-2475)。Thiery JP 等研究提不，Imai N 等得到的細(xì)胞可能是由于體外培養(yǎng)導(dǎo)致上皮細(xì)胞產(chǎn)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransitions, EMT)而產(chǎn)生的，這種狀態(tài)下的細(xì)胞表現(xiàn)出某些袓細(xì)胞樣的特性，但不產(chǎn)生相應(yīng)的袓細(xì)胞功能(Thiery JPj Acloque H，Huang RYj et al. Epithelial-mesenchymaltransitions in development and disease. Cell. 2009.139: 871-890)。有研究人員利用⑶133、⑶24、干細(xì)胞抗原-I (Sca-I)和受體酪氨酸蛋白激酶等表面標(biāo)志物，在腎間質(zhì)(interstitium)和腎小球囊的泌尿極中分離鑒定干細(xì)胞(Lazzeri Ej CrescioliC， Ronconi E, et al. Regenerative potential of embryonic renal multipotentprogenitors in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2007. 18: 3128-3138)。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些表面標(biāo)志物在分化的上皮細(xì)胞中均有很高的表達(dá)。因而，利用這些非特異性的表面標(biāo)志物得到的細(xì)胞，很難區(qū)分是真正的干細(xì)胞，還是有某些祖細(xì)胞特性的上皮細(xì)胞，或者是間質(zhì)/基質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal stromal cell)。因而，利用特異表面標(biāo)志是尋找分離腎源干細(xì)胞的最有效方法。Dekel B等比較人胚胎腎細(xì)胞和小兒腎惡性Wilms’瘤的表達(dá)譜，鑒定的胚胎腎源干細(xì)胞表面標(biāo)志基因包括神經(jīng)細(xì)胞粘附分子I (neural cell adhesion molecule I, NCAM1, CD56),聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子 I (poly-sialated neural cell adhesion molecule 1PSA-NCAM1)，F(xiàn)ZD7, FZD2, DLKl, ACVRIIB 和 NTRK2 (Dekel B, Metsuyanim S, Schmidt-Ott KM, etal. Multiple imprinted and sternness genes provide a link between normal andtumor progenitor cells of the developing human kidney. Cancer Res. 2006. 66:6040-6049)。Metsuyanim S等根據(jù)Dekel B等的研究結(jié)果,利用NCAMl成功定位并分離了人胚胎的腎干細(xì)胞(Metsuyanim S，Harari-Steinberg O, Buzhor E, et al. Expressionof stem cell markers in the human fetal kidney. Plos One. 2009. 4: e6709)o 然而，由于本專(zhuān)利技術(shù)人對(duì)成體腎源干細(xì)胞生物學(xué)特性以及基因表達(dá)特點(diǎn)認(rèn)識(shí)的匱乏，迄今仍無(wú)法利用特異表面標(biāo)志物對(duì)其進(jìn)行直接高效的分離。這也限制了成體腎源干細(xì)胞在腎疾病治療研究的開(kāi)展。巢蛋白(Nestin)作為中間絲蛋白家族成員之一，在胚胎發(fā)育過(guò)程中廣泛表達(dá)，最早的表達(dá)時(shí)間出現(xiàn)在胚胎發(fā)育本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種分離腎源干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)巢蛋白，所述方法包括：提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白？綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；飼養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的小鼠至1周齡或以上，分離小鼠腎，用膠原酶IV和胰蛋白酶消化，過(guò)濾消化后的細(xì)胞懸液，篩除腎結(jié)締組織、腎小管和細(xì)胞團(tuán)塊，獲得單個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞產(chǎn)生受巢蛋白增強(qiáng)子控制的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；將上述單個(gè)細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，用C57B/6小鼠細(xì)胞做陰性對(duì)照細(xì)胞，收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的腎源干細(xì)胞或祖細(xì)胞。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：項(xiàng)鵬，姜美花，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：廣東江源生物科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：