干擾素α5的制備方法技術(shù)

一種在產(chǎn)生IFNa5的大腸桿菌宿主細胞中通過表達產(chǎn)生干擾素α5（IFNa5）蛋白質(zhì)的方法，該方法使得多肽鏈的N-末端的額外甲硫氨酸殘基的摻入以及氧化類型的產(chǎn)生最小化。IFNa5蛋白質(zhì)可以使用有效的方法來純化從而產(chǎn)生有生物活性的IFNa5。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及在生產(chǎn)IFNa5的大腸桿菌宿主細胞中通過表達來生產(chǎn)干擾素α 5(IFNa5)蛋白質(zhì)的方法，其中該多肽鏈的N-末端的額外的甲硫氨酸殘基的摻入以及其氧化類型的產(chǎn)生均為最小化的。IFNa5蛋白質(zhì)可以使用有效的方法來純化從而產(chǎn)生生物學(xué)上有活性的IFNa5。
技術(shù)介紹
干擾素(IFN)是ー組天然產(chǎn)生的多效糖蛋白，被稱為細胞因子，不同種類的細胞(上皮細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞)在受到一系列的刺激(病毒、細菌、細胞、腫瘤和大分子)誘導(dǎo)之后會分泌產(chǎn)生，并且具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)特性以及鎮(zhèn)痛作用。在內(nèi)源產(chǎn)生或給藥之后，干擾素與細胞表面的特異性受體相互作用，并開始信號從細胞質(zhì)到達細胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)編碼具有抗病毒和免疫刺激活性的特定蛋白質(zhì)的基因的表達。人們已經(jīng)認識到了 IFN的醫(yī)用潛力，如許可在人體上施用的ー些不同種類的IFN，例如作為藥物來治療多發(fā)性硬化的IFNla (Rebif，Avonex)、IFNlb (Betaseron)，以及作為藥物來治療惡性病(癌癥)和病毒病的重組人IFNa2a (Roferon A)和IFNa2b (Intron A)。基于IFN通過其來傳遞信號的受體的種類，人IFN分為三個主要的類型，S卩，(i)IFN I型，(ii)IFN II 型,以及IFN III型。被稱為I型IFN的IFNa和β在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，在酸性pH中穩(wěn)定，并且競爭相同的細胞受體(IFNAR)。目前，IFNa、β和Y可以通過重組的形式來制備，這具有雙重優(yōu)勢，可以獲得比通過從天然來源(白細胞、成纖維細胞、淋巴細胞)分離的高出很多數(shù)量的產(chǎn)物，并且降低了純化和檢測產(chǎn)物安全性的方法的復(fù)雜程度。事實上，大部分市售藥用級重組體IFN是由大腸桿菌產(chǎn)生并純化獲得的。大腸桿菌重組蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)已經(jīng)是，并且仍然是，生產(chǎn)IFN所選擇的系統(tǒng)。實際上，IFN基因沒有內(nèi)含子，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物一般是非糖基化的。而且，大腸桿菌可以迅速地生長到高細胞密度，并且被用來生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的菌株已經(jīng)進行了遺傳修飾，從而一般認為其對于大規(guī)模的發(fā)酵是安全的。IFN cDNA的表達是在其最初被克隆之后不久在大腸桿菌中直接完成的。事實上，IFNa (IFNa)是最先通過大腸桿菌用DNA重組技術(shù)的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)之ー 。然而，IFN在大腸桿菌中的表達顯示出了ー些問題。在大腸桿菌中大量表達的IFN經(jīng)常沉淀形成不溶的被稱為包涵體(IB)的聚集體簡言之，一般情況下，形成錯誤折疊的蛋白質(zhì)，因此在生物學(xué)上不具有活性 0為了得到天然形式的蛋白質(zhì)，需要將所述的IB進行變性處理，隨后進行復(fù)性、氧化，如果那樣的話，需要形成如在天然蛋白中的ニ硫鍵。而且，靶蛋白序列(例如，IFN) N-末端的另外的甲硫氨酸殘基的摻入是在大腸桿菌中表達蛋白質(zhì)的ー個特征。眾所周知，分布在蛋白質(zhì)序列中的甲硫氨酸殘基易于氧化。這些步驟可能發(fā)生在生產(chǎn)蛋白質(zhì)或包含所述蛋白質(zhì)的藥物組合物(如果其能被用作藥物，例如IFN)的過程中，并且更多發(fā)生在高溫下長期保存的時期內(nèi)。雖然已經(jīng)開發(fā)了多種在細菌中生產(chǎn)和純化IB形式的IFN的方法，但是還存在阻礙成功生產(chǎn)和IFN，即治療水平的IFN的其他因素，例如必須清除在目標IFN的N-末端摻入的額外甲硫氨酸殘基以及產(chǎn)生的其氧化類型(如果該產(chǎn)物用作藥)，因此降低了 IFN生產(chǎn)的總得率，増加了純化過程的復(fù)雜性，并且使得生產(chǎn)和純化治療水平的a IFN的方法很費力。因此，仍需要能夠在大腸桿菌宿主細胞中以高得率和經(jīng)濟有效的方式來生產(chǎn)治療水平的IFNa，特別是IFNa5的方法。專利技術(shù)概述專利技術(shù)人出人意外地發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素(痕量元素)的濃度在IFNa5的翻譯后修飾中起了重要的作用。因此，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素的濃度，可能使產(chǎn)生IFNa5的大腸桿菌宿主細胞中IFNa5的N-末端的額外的甲硫氨酸殘基的摻入最小化，并且使其氧化類型的產(chǎn)生最小化，提高產(chǎn)品得率并簡化純化過程，因此使得在產(chǎn)生IFNa5的大腸桿菌宿主細胞中以經(jīng)濟有效復(fù)雜度低的方法來生產(chǎn)和純化IFNa5，即治療水平的IFNa5。實施例4示出了氧化甲硫氨酸化的人IFNa -5(hIFNa5)形式的形成被有效清除，并且こ酰化的hIFNa5形式的量降低了兩倍(即成為原來的一半)，其中I升(L)的碳料液包含大約3. OmL至大約3. 7mL的微量元素原液，并且，優(yōu)選地，在誘導(dǎo)之后的平均特定培養(yǎng)物生長率(μ)等于或大于O. 17。因此，一方面，本專利技術(shù)涉及在產(chǎn)生IFNa5的大腸桿菌宿主細胞中表達干擾素α 5 (IFNa5)蛋白質(zhì)的方法，其包括a)提供一種產(chǎn)生IFNa5的大腸桿菌宿主細胞；b)在通過所述產(chǎn)生IFNa5的重組大腸桿菌宿主細胞中有效表達所述IFNa5蛋白的條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)該產(chǎn)生IFNa5的大腸桿菌宿主細胞，所述發(fā)酵培養(yǎng)基添加碳料液，其中-所述發(fā)酵培養(yǎng)基不含動物來源或酵母來源的組分，并且-所述碳料液包括碳源以及每升添加的碳料液中大約3.O至大約3. 7mL的微量元素溶液；并且c)分離和任選地純化表達的IFNa5蛋白質(zhì)。在ー個特定的具體實施方式中，所述大腸桿菌宿主細胞是大腸桿菌蛋白酶缺陷型菌株，如大腸桿菌Ion_/ompT_蛋白酶缺陷型宿主菌株,優(yōu)選為大腸桿菌BL21菌株,最優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)菌株。在另ー個特定的具體實施方式中，當(dāng)大腸桿菌菌株是大腸桿菌BL21(DE3)菌株時，步驟b)的條件包括用IPTG誘導(dǎo)。在另ー個特定的具體實施方式中，步驟c)分離和純化表達的IFNa5蛋白質(zhì)包括依次地，在裂解大腸桿菌宿主細胞之后，通過將所述IB進行增溶來分離所述的包涵體形式的IFNa5蛋白質(zhì)(IB)，并將獲得的混合物進行氧化復(fù)性，以及進行連續(xù)的一系列色譜法，以獲得純化的IFNa5，所述色譜法包括I)將包括復(fù)性的IFNa5的混合物進行疏水作用層析；2)將步驟I)獲得的溶液進行陰離子交換色譜； 3)將步驟2)獲得的溶液進行第一陽離子交換色譜；并且4)將步驟3)獲得的溶液進行第二陽離子交換色譜，任選地，其中所述溶液用包括甲硫氨酸的緩沖液進行稀釋，在ー個特定的具體實施方式中，所述IFNa5是，優(yōu)選是，人IFNa5 (hIFNa5)。附圖說明圖I示出了構(gòu)建IFNa5產(chǎn)生菌株的流程圖。圖2示出了初始質(zhì)粒DNA pET28_IFN α -5的限制性內(nèi)切酶酶切分析結(jié)果。泳道1-3和5-7 pET28-IFN α -5的限制性內(nèi)切酶酶切分析；泳道I和5 pET28-IFN α -5/BamHI ;泳道 2 和 6 pET28-IFN a -5/NdeI ;泳道 3 和 7 :pET28_IFN a -5/NdeI+BamHI ；泳道 4 和 8 pET28-IFN α-5，未切害I]。DNA 分子標記(Gene Ruler DNA LadderMix, Fermentas, Lithuania)條帶的大小以千堿基對(kbp)來表示。圖3示出了中間物質(zhì)粒IFN α-5的限制性內(nèi)切酶酶切分析結(jié)果。該質(zhì)粒源于單克隆。DNA 分子標記(Gene Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Lithuania)條帶的大小以kbp表示。預(yù)期的片段大小(以bp計)在括號內(nèi)給出。泳道I :pUC57-IFN α-5本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：巴爾達斯·阿爾吉爾達斯·布梅里斯，
申請(專利權(quán))人：迪格納生物技術(shù)公司，
類型：
國別省市：