本發明專利技術涉及適于從包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的糖組合物中生產一種或多種發酵產物的細胞，其中所述細胞包含2至15個拷貝的一種或多種木糖異構酶基因或2至15個拷貝的一種或多種木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，以及2至10個拷貝的araA、araB和araD基因，其中，這些基因被整合進細胞基因組中。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及適于發酵包含多種C5和/或C6糖的糖組合物(此類組合物在本文中被命名為混合的糖組合物)的細胞。混合的糖組合物可源自木質纖維素材料。本專利技術還涉及使用混合糖細胞由混合的糖組合物生產發酵產物的方法。_2]專利技術背景 作為化石燃料的替代品生產的大部分乙醇目前來自于對玉米淀粉和基于甘蔗的蔗糖的發酵。為了達成生產可更新燃料的宏偉目標，已開發了新的技術，用于將非食物生物質轉化成發酵產物，例如乙醇。Saccharomycescerevisiae是乙醇工業中所選擇的生物，但是其不能利用生物質原料的半纖維素組分中含有的五碳糖。半纖維素可占生物質的20-30%，其中木糖和阿拉伯糖是最豐富的C5糖。木糖異構酶(XI)的異源表達是使得酵母細胞能夠代謝和發酵木糖的一種選擇。類似地，細菌基因araA、araB和araD在S.cerevisiae菌株中的表達導致阿拉伯糖的利用和高效的醇發酵。半乳糖是C6糖,其也是通常存在于木質纖維素中的糖，就經濟上的原因而言通常其含量(總糖的 4%)不應被忽略。J. van den Brink et al, Microbiology (2009) 155,1340-1350 公開了葡萄糖是Saccharomyces cerevisiae偏好的碳源,并且從葡萄糖受限的發酵條件轉換為厭氧條件下半乳糖過量的條件后，半乳糖不被消耗。迄今為止尚無公開在與葡萄糖相同的方法中將葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖轉化成發酵產物的方法。
技術實現思路
本專利技術的目標是提供能將葡萄糖、木糖和半乳糖和甘露糖(即，四種糖的混合物)轉化為發酵產物的細胞。本專利技術的另一目標是提供能將葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖(即，五種糖的混合物)轉化為發酵產物的此類細胞。本專利技術的進一步的目標是提供穩定的此類上文定義的細胞。本專利技術的進一步的目標是提供無標記物的此類上文定義的菌株。本專利技術的進一步的目標是提供這樣的方法，其中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖被同時轉化為發酵產物。根據本專利技術實現這些目標的一個或多個。本專利技術提供了適于由包含葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖的糖組合物生產一種或多種發酵產物的細胞，其中所述細胞包含2至15個拷貝的一種或多種木糖異構酶基因或2至15個拷貝的一種或多種木糖還原酶和木糖醇脫氫酶和2至10個拷貝的araA、araB和araD基因，其中這些基因被整合進細胞基因組中。本專利技術進一步提供了用于由包含葡萄糖、阿拉伯糖和木糖和任選地半乳糖和/或甘露糖的糖組合物生產一種或多種發酵產物的方法，所述方法包括下述步驟a)在下述混合糖細胞的存在下發酵糖組合物，所述混合糖細胞包含2至15個拷貝的一種或多種木糖異構酶基因和/或2至15個拷貝的一種或多種木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，其中這些基因被整合進細胞基因組中；和b)回收發酵產物。在一種實施方式中，混合物的糖細胞是Saccharomyces屬的細胞。在一種實施方式中，混合物的糖細胞是Saccharomyces cerevisiae種。在一種實施方式中，發酵產物是乙醇。 附圖說明圖I展示了質粒pPWT006的物理圖譜。圖2展示了質粒pPWT018的物理圖譜。圖3展示了 Southern印跡放射自顯影圖。用EcoRI和HindIII 二者消化野生型菌株CEN. PK113-7D (泳道I)和BIE104A2 (泳道2)的染色體DNA。將印跡與特異性的SIT2-探針雜交。圖4展示了質粒pPWT080的物理圖譜，其序列在SEQ ID NO 8中給出。圖5展示了在不同培養基上BIE104P1A2在需氧條件下的生長曲線。在YNB 2%半乳糖上預培養菌株BIE104A2P1。生長曲線在2%半乳糖和I %阿拉伯糖上開始，之后是在圖中由數字(I)標注的事件轉移至含2%阿拉伯糖作為唯一碳源的YNB上。達到高于I的OD 600后，將培養物轉移至具有O. 2的起始OD 600的新鮮培養基上。在純阿拉伯糖培養基上轉移三次后，將得到的菌株命名為BIE104P1A2C。圖6展示了在2%阿拉伯糖作為唯一碳源的YNB上，BIE104P1A2C在厭氧條件下的生長曲線。達到高于I的OD 600后，將培養物轉移至具有O. 2的起始OD 600的新鮮培養基上。若干次轉移后，將得到的菌株命名為BIE104PlA2d( = BIE201)。圖7展示了質粒pPWT042的物理圖譜，其序列在SEQ ID NO 14中給出。圖8展示了轉化混合物在需氧條件下的生長曲線。用片段XlS-Tyl轉化菌株BIE201X9并且轉化混合物用來接種補充有2%木糖的Verduyn-培養基。在OD 600達到約35后，一小份的培養物用來接種具有新鮮培養基的第二搖瓶。從第二搖瓶中分離用于進一步分析的菌落。圖9展示了在補充有2%葡萄糖或2%木糖或2%阿拉伯糖或2%半乳糖的Verduyn-培養基上單個菌落隔離群的生長。圖10展示了在補充有2%木糖或2%阿拉伯糖的Verduyn-培養基上經選擇的單個菌落隔離群的生長。圖11展示了在補料分批實驗中，在合成培養基上菌株BIE104PlY9mc和BIE201的混合培養物的糖轉化和產物形成。持續測量CO2產生。通過跟蹤培養物的光密度來監測生長。預培養物在2%葡萄糖上生長。圖12展示了在補料分批實驗中，在合成培養基上菌株BIE252的糖轉化和產物形成。持續測量CO2產生。通過跟蹤培養物的光密度來監測生長。預培養物在2%葡萄糖上生長。圖13展示了在補料分批實驗中產生的總CO2。圖14展示了在分批實驗中，在合成培養基上菌株BIE104PlY9mc和BIE201的混合培養物的糖轉化和產物形成。持續測量CO2產生。通過跟蹤培養物的光密度來監測生長。預培養物在2%葡萄糖上生長。圖15展示了在分批實驗中，在合成培養基上菌株BIE252的混合培養物的糖轉化和產物形成。持續測量CO2產生。通過跟蹤培養物的光密度來監測生長。預培養物在2%葡萄糖上生長。圖16展示了在分批實驗中產生的總C02。圖17展示了在13.8% d. m下的水解的玉米纖維中菌株BIE252的性能。示出了C02產生率、乙醇生產和糖轉化。圖18展示了在10% d.m下的水解的玉米秸桿中菌株BIE252的性能。示出了 C02產生率、乙醇生產和糖轉化。圖19展示了在10% d.m下的水解的小麥秸中菌株BIE252的性能。示出了 C02產 生率、乙醇生產和糖轉化。 圖20a展示了菌株BIE252的糖轉化(率)。圖20b展示了在具有2%葡萄糖的YEP-培養基中培養超過100代后，菌株BIE252的單個菌落隔離群的糖轉化(率)。圖20c展示了在具有2%葡萄糖的YEP-培養基中培養超過100代后，菌株BIE252的單個菌落隔離群的糖轉化(率)。圖21展示了質粒pPWT148的物理圖譜。圖22展示了質粒pPWT152的物理圖譜。圖23展示了用溴化乙錠染色的CHEF凝膠。使用CHEF技術根據它們的尺寸分離染色體。分析的菌株是BIE104(未轉化的酵母細胞)、BIE104A2Pla (不能消耗阿拉伯糖的第一轉化體，BIE104A2P1的同物異名)、通過適應性進化得自BIE104A2P1的菌株BIE104A2P1C(其能在阿拉伯糖上生長)、通過適應性進化得自BIE104A本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：保羅·克萊斯森，比安卡·伊麗莎白·瑪麗亞·吉勒森，吉斯博蒂娜·皮特奈拉·蘇勒庫姆·范，威爾伯特·赫爾曼·馬里·海涅，
申請(專利權)人：帝斯曼知識產權資產管理有限公司，
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