本發明專利技術提供用于將成纖維細胞轉化為PV神經元的組合物，所述組合物含有Ascl1基因以及FSK中的一種或多種。本發明專利技術還提供了一種將成纖維細胞轉化為神經元細胞的方法。本發明專利技術還提供了根據本發明專利技術的方法制備的神經元細胞。在制備用于治療神經系統疾病的藥物中的應用。本發明專利技術還提供了根據本發明專利技術的方法制備的神經元細胞在制備用于治療神經系統疾病的藥物中的應用。本發明專利技術通過試驗證明，所述轉分化技術可以高效獲得PV神經元，移植后很好的治療癲癇疾病，通過癲癇發作次數的降低，提高記憶力，從而為治療癲癇及相關疾病的治療開辟了新的途徑。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術和神經發育領域。本專利技術具體涉及。
技術介紹
基于干細胞移植技術的再生醫學為人類戰勝難治性退行性疾病帶來了巨大的希望。誘導多能干細胞由于突破了胚胎干細胞的倫理障礙，曾被認為是再生醫學的新希望。然而，其誘導效率的低下，批次間的不穩定性及高致瘤性使其很難直接用于疾病治療。自2010年以來，國內外一些科學家通過表達特定轉錄因子實現了將一種類型的成體細胞轉變為另一種類型的成體細胞或成體干細胞。這一方法被稱為“轉分化”。這一技術不需要經歷多能性干細胞這一中間狀態，因此可以降低致癌風險。如果能將人體內的其他細胞直接轉變為疾病治療所需要細胞類型，則可以避免細胞移植帶來的一系列問題。因此轉分化技術有可能為退行性疾病和器官機械損傷等疾病提供良好的治療方法，具有廣闊的臨床應用價值。小白蛋白Parvalbumin(PV)是一種腦中特異的重要的神經元。小白蛋白最先是從蛙與魚的肌肉中分離出來的一種水溶性酸性蛋白質，分子量大約12K，被稱為“低分子白蛋白”。1981年，發現PV存在于神經組織內，并且發現含PV的神經元分布與GABA神經元的分布有很高的一致性，因而開始了神經組織中含PV神經元的研究，也對GABA神經元的研究提出了新的內容。PV神經元在大腦中的分布比較廣泛，PV神經元屬于GABA神經元家族，在腦中發揮獨特的功能，維持腦電活動的平衡，已有報道癲癇疾病可能由于PV神經元的異常引起的。癲癇是神經系統常見疾病之一，癲癇已成為神經內科的第二大常見疾病，患病率僅次于腦卒中。世界衛生組織統計，截止到2013年，我國約有近1000萬癲癇患者，其中600萬名為活動性癲癇患者，且每年新增癲癇患者40萬名，給社會、家庭和個人帶來了沉重的負擔。癲癇是慢性反復發作性短暫腦功能失調綜合征。以腦神經元異常放電引起反復癇性發作為特征。癲癇的發病率與年齡有關。一般認為1歲以內患病率最高，其次為1?10歲以后逐漸降低。癲癇由大腦神經元異常放電，導致短暫中樞神經系統功能失常的慢性腦部疾病，根本原因是興奮性與抑制性神經遞質的失衡。通過移植抑制性神經元治療此類疾病已經取得了很好的效果。但抑制性神經元的來源極大的限速了癲癇病的治療。
技術實現思路
因此，本專利技術的目的是針對當前無法高效獲得抑制性神經元的不足，提供一種誘導成纖維細胞轉分化為神經元細胞的方法。同時，本申請提供了將所述神經元細胞用于治療神經系統癲癇相關疾病的用途，從而為癲癇或其它神經相關疾病的治療開辟新的治療途徑。除非特別指明，本說明書中的“PV”神經元均指小白蛋白神經元。除非特別說明，本說明書中的“FSK”均指福思科林(Forskolin)，是一種分離自印度植物(Coleus forskohlii)的天然二貓產物，細胞生理學實驗研究中Forskolin通常用來提高環腺苷酸(cAMP)水平。針對上述目的，本專利技術提供的技術方案如下:一方面，本專利技術提供一種組合物，所述組合物用于將成纖維細胞轉分化為神經元細胞，所述組合物含有Ascll基因和FSK。優選地，所述神經元細胞為PV神經元細胞。另一方面，本專利技術還提供了上述組合物的用途，所述組合物用于制備將成纖維細胞轉分化為神經元細胞，優選PV神經元細胞的試劑。本專利技術還提供了一種用于將成纖維細胞轉分化為神經元細胞的培養基，所述培養基中含有FSK，優選地，所述FSK的濃度為5-30 μ Μ，優選10 μ Μ ;優選地，將FSK溶于水，制備為一定濃度的儲液，然后用于制備上述培養基，優選地，所述FSK儲液的濃度為0.5M-1M ；優選地，所述神經元培養基由DMEM培養基、B-27添加劑、腦源性神經營養因子(BDNF)和FSK組成，其中，所述各成分的比例為每1升培養基中含有980毫升的DMEM培養基，20毫升50XB-27添加劑，10微升10 μ g/ml BDNF以及5_30微升1M的FSK儲液。再一方面，本專利技術提供了一種將成纖維細胞轉分化為神經元細胞的方法，所述方法包括以下步驟:1)將Ascll基因導入成纖維細胞；優選地，所述成纖維細胞為小鼠成纖維細胞； 優選地，所述成纖維細胞使用DMEM培養基加10%胎牛血清培養基培養；優選地，所述Ascll基因使用腺病毒pAD載體導入成纖維細胞；2)將已導入Ascll基因的成纖維細胞，使用含有FSK的神經元培養基培養；得到神經元細胞。優選地，所述方法還包括步驟3)鑒定神經元細胞，優選地，所述鑒定神經元的方法為免疫組化法。優選地，所述步驟1)是通過包括以下步驟的方法實現的:a.腺病毒載體構建:將Ascll基因通過BamHI+EcoRI雙酶切構建到腺病毒pAD載體；b.小鼠成纖維細胞細胞的制備:選取14.5天的小鼠胚胎，取皮膚組織，用0.5%胰酶消化，使用DMEM加10%胎牛血清培養消化后的皮膚成纖維細胞，2天后傳代一次，得到成纖維細胞；c.病毒感染:使用步驟a構建的Ascll腺病毒顆粒，感染成纖維細胞，從而將Ascll基因導入成纖維細胞；優選地，所述步驟1)是通過包括以下步驟的方法實現的:將Ascll基因導入成纖維細胞6小時后。使用本專利技術所述的培養基培養，之后每兩天更換一次培養基，誘導10后，得到神經元細胞。優選地，所述鑒定神經元細胞是通過包括以下步驟的方法實現的:將神經元細胞通過4%多聚甲醛固定，之后用5% BSA封閉，之后用兔的Tujl —抗孵育過夜，第二天用PBS洗3遍，然后用cy3鏈接的驢抗兔的二抗孵育1小時，在熒光顯微鏡下觀測細胞形態和染色結果。再一方面，本專利技術還提供了根據本專利技術的方法制備的神經元細胞。本專利技術提供了上述組合物在制備用于治療神經系統疾病的藥物中的應用。本專利技術還提供了根據本專利技術的方法制備的神經元細胞在制備用于治療神經系統疾病的藥物中的應用。優選地，所述神經系統疾病為癲癇病。本專利技術通過試驗證明，所述轉分化技術可以高效獲得PV神經元，移植后很好的治療癲癇疾病，通過癲癇發作次數的降低，提高記憶力，從而為治療癲癇及相關疾病的治療開辟了新的途徑。【附圖說明】以下，結合附圖來詳細說明本專利技術的實施方案，其中:圖1為本專利技術獲得的神經細胞；其中，A圖為感染的GFP細胞；B圖為神經元特異抗體Tu j 1免疫組化染色；C圖為感染GFP細胞與Tujl染色共標；“GFP”代表感染的成纖維細胞，“Tujl”代表轉分化神經元的Tujl抗體染色，“GFP/Tujl”綠色的感染細胞有多少轉分化為神經元；圖2表明轉分化神經細胞是PV神經元；其中，A圖為PV神經元特異抗體PV免疫組化染色；B圖為神經元特異抗體Tujl免疫組合染色；C圖為PV與Tu j 1抗體染色共標；其中:“PV”代表PV神經元特異標記PV抗體染色，“Tujl”代表轉分化神經元的Tujl抗體染色；圖3為移植神經細胞的示意圖，其中1處為移植細胞，2處為海馬區DAPI染色；圖4表明的是制作癲癇小鼠的模型，其中左邊是正常小鼠對照組，右邊是癲癇小鼠模型組；圖5表明癲癇小鼠移植抑制性PV神經元后，曠場實驗表明小鼠癲癇癥狀得到恢復其中:“0)11壯01”代表正常對照組，1?11印#”代表癲癇小鼠組，“？￥-!1(:”代表移植組；【具體實施方式】除非特別指明，以下實施例中所用的C57BL/6J小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。除非特別指明，以下實施本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種組合物，所述組合物用于將成纖維細胞轉分化為神經元細胞，所述組合物包括Ascl1基因和FSK；優選地，所述神經元細胞為PV神經元細胞。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：焦建偉，史子嘯，
申請(專利權)人：中國科學院動物研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。