改變細胞分化狀態的方法及其組合物技術

本發明專利技術提供利用創新的編碼轉錄因子的蛋白質表達構建物改變細胞分化狀態的方法。本文所述的方法和組合物可用于生成誘導多潛能干（iPS）細胞，和使多種外遺傳狀態的細胞分化、轉分化或去分化。本方法包括將核酸構建物或其表達產物引入細胞，和在使細胞有效轉化成為多潛能細胞，增強多潛能狀態保持力或使細胞有效轉化成為相應于內胚層、中胚層或外胚層的細胞系的細胞的培養條件下培養細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】改變細胞分化狀態的方法及其組合物專利技術背景專利
本專利技術一般涉及干細胞，更具體地涉及改變細胞分化狀態的方法和組合物，以及由其生成的細胞。背景信息在胚胎發育期間，機體組織由三個主要細胞群形成外胚層、中胚層和內胚層。這些細胞群，也被稱為主要的生殖細胞層，通過被稱為原腸胚形成的過程形成。在原腸胚形成后，各主要生殖細胞層生成細胞群和組織的特定組。例如，中胚層生成血液細胞、內皮細胞、 心肌和骨骼肌和脂肪細胞；內胚層生成肝、胰和肺；以及外胚層生成神經系統、皮膚和腎上腺組織。人胚胎干(hES)細胞是可分化成多種細胞類型的多潛能細胞。當被注入免疫缺陷型小鼠時，胚胎干細胞形成分化的腫瘤(畸胎瘤)。但是，經體外誘導形成胚狀體(EBs)的胚胎干細胞提供胚胎干細胞系的來源，該胚胎干細胞系能夠在特定生長條件下分化出具有幾種組織的特性的多種細胞類型。已知多種方法用于鼠體細胞和人體細胞程序重排成多潛能干細胞一被稱為誘導多潛能干(iPS)細胞。在程序重排后，可開始將iPS細胞分化成特定組織類型。多種干細胞類型及其后代適于程序重排、分化、去分化和轉分化，并且是正常人細胞的重要來源，用于治療性移植——如肝細胞，和用于藥物測試和開發。這樣的目標需要足夠的細胞分化成適于患者需要或適當的藥理學測試的組織類型。與此相關，需要有效和可信賴的改變細胞分化狀態的方法，如通過程序重排、分化、去分化和轉分化細胞。本文提供了這種方法，能夠產生同一分化狀態的高度富集的細胞群。專利技術概述本專利技術基于創新的方法和核酸構建物的原始發現，其用于改變細胞分化狀態，如程序重排細胞以生成誘導多潛能干(iPS)細胞，和使多種分化狀態下的細胞發生分化、轉分化或去分化。因此，本專利技術提供使目標或受體細胞程序重排、分化、轉分化或去分化成不同細胞類型的細胞或者多潛能或分化程度較低的細胞的方法。本方法包括在使細胞轉化成多潛能細胞或相應于內胚層、中胚層或外胚層的細胞系的細胞的培養條件下，將核酸構建物或其表達產物引入細胞和培養物。在多個方面中，本方法利用編碼表達盒(cassette)的核酸構建物，該表達盒包括處于可操作連接中的i)至少一種蛋白質標記；ii)蛋白質轉導結構域；iii)融合結構域；iv)核定位信號；和V)至少一種轉錄因子。因此，本專利技術進一步提供核酸構建物。在一個實施方式中，構建物的轉錄因子是分化或轉分化中涉及的核程序重排因子或轉錄因子。在多個方面，轉錄因子由SOX族基因、KLF族基因、MYC族基因、SALL4、0CT4、NANOG、LIN28或其組合如0CT4、S0X2、KLF4、NANOG或c_MYC編碼。在相關方面，轉錄因子由如下基因編碼包括 0CT4、NANOG, S0X2、S0X17、HNF4、GATA4、HHEX, CEBP β、CEBP δ、PRDM16、MYODU ΝΚΧ2. 5、MEF2c、MYOCARDIN、RUNX2、PDX, NGN、SALL4 或 S0X9、或其組合，如0ct4、NANOG、Sox2、Sox9、Soxl7、HNF4 a 2、HNF4 a 4、HNF4 a 7、HNF4 a 8、HNF4 y、GATA4、Hhex、CEBP β、CEBP δ、PRDMl6、MyoDl、NKX2. 5、Mef2c、心肌素、Runx2_I、Pdxl、Ngn3、Sal 14或 Runx2_IIo在多個方面，核酸構建物編碼至少一種蛋白質標記，如聚(His)、血細胞凝集素(HA)表位、myc表位、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、鈣調蛋白結合肽、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、FLAG八肽、nus、綠色熒光蛋白(GFP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、V5、S-蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、SBP、聚(Arg)、DsbA、c-myc-標記、HAT、纖維素結合結構域、softagl、softag3、小泛蛋白樣改造劑(SUMO)、泛蛋白(Ub)、或其組合。在一個實施方式中，核酸構建物編碼至少兩種蛋白質標記，如親和標記和表位標記。在相關實施方式中，該至少兩種蛋白質標記包括聚(His)標記和血細胞凝集素(HA)表位標記。在多個方面中，核酸構建物編碼融合結構域。在一個實施方式中，融合結構域包括 流感血凝素融合肽或其片段。在相關方面，核酸構建物編碼蛋白質轉導結構域。在一個實施方式中，蛋白質轉導結構域包括TAT蛋白、VP22蛋白、果蠅觸角足(Antennapedia, Antp)同源異型轉錄因子、或其片段。一方面，核酸構建物編碼處于可操作連接中的轉錄因子、聚(His)標記、血細胞凝集素(HA)標記、TAT蛋白、流感血凝素融合肽和核定位信號(NLS)。在多個實施方式中，各元件被I至10個氨基酸隔開。在示例性實施方式中，各元件間隔至少2個氨基酸，如甘氨酸，以允許各元件自由旋轉，而與各單獨元件無關。在多個方面，目標或受體細胞在核酸構建物或其表達產物被引入細胞前可以是未分化、部分分化或完全分化的。在相關方面，目標或受體細胞可以是胚胎干(ES)細胞、多潛能干(PS)細胞、誘導多潛能干(iPS)細胞、單性生殖干細胞、多能性干細胞、雙能干細胞、間充質干細胞、內胚層干細胞、外胚層干細胞、體干細胞或體細胞。另一方面，核酸構建物編碼至少一種另外的表達盒，其均包括處于可操作連接中的i)至少一種蛋白質標記；ii)蛋白質轉導結構域；iii)融合結構域；iv)核定位信號；和V)至少一種轉錄因子。因此，多種轉錄因子可由單個核酸構建物表達。類似地，為允許表達多于一種轉錄因子，至少一種另外的核酸構建物或其表達產物如本文所述可被引入細胞。另一方面,本專利技術提供表達載體，其包含本專利技術的核酸構建物。另一方面，本專利技術提供分離的蛋白質，其由本專利技術的核酸構建物編碼。核酸構建物的表達生成嵌合蛋白質，其包括融合于至少一種蛋白質標記的轉錄因子、蛋白質轉導結構域、融合結構域和NLS，各元件處于任何順序。另一方面，本專利技術提供生成誘導多潛能干細胞(iPS)的方法，該誘導多潛能干細胞的功效程度高于原始未改變的轉錄因子。本方法包括利用多種嵌合蛋白質使體細胞程序重排成iPS細胞，該嵌合蛋白質包括融合于至少一種蛋白質標記的轉錄因子、蛋白質轉導結構域、融合結構域和NLS，各元件處于任何順序。另一方面，本專利技術提供增強多潛能干細胞的多潛能性的保持力的方法，該多潛能干細胞包括胚胎干細胞或單性生殖干細胞。本方法包括利用多種嵌合蛋白質使所述多潛能干細胞培養物中存在的分化細胞程序重排成為多潛能干細胞，該嵌合蛋白質包括融合于至少一種蛋白質標記的轉錄因子、蛋白質轉導結構域、融合結構域和NLS，各元件處于任何順序。另一方面，本專利技術提供引導多能性干細胞或多潛能干細胞(包括胚胎干細胞、單性生殖干細胞或誘導多潛能干細胞)分化成目標終點(fate)的 方法。本方法包括利用多種嵌合蛋白質使在胚狀體形成期間生成的不需要的分化細胞程序重排，該嵌合蛋白質包括融合于至少一種蛋白質標記的轉錄因子、蛋白質轉導結構域、融合結構域和NLS，各元件處于任何順序。還有另一方面，本專利技術提供利用由本文所述方法得到的細胞治療個體的方法，其中最初生成iPS細胞，隨后其分化成特定細胞類型。本方法包括從個體得到體細胞；利用本專利技術的方法使體細胞程序重本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：T·克里斯蒂安森韋伯，
申請(專利權)人：國際干細胞公司，
類型：
國別省市：