用于培養干細胞的制劑和方法技術

本發明專利技術涉及適用于干細胞衍生、維持和分化的血清替代制劑和適用于干細胞衍生、維持和分化的培養基，其包括共軛亞油酸、二十碳五烯酸、活化素A和/或硬脂酸。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于干細胞(如人類胚胎干細胞)衍生、維持和分化的不含異源物的制劑。
技術介紹
人類胚胎干細胞(hESCs)是多潛能細胞，其具有分化成人體的所有細胞類型的潛·能。人類ESCs具有重大的治療意義，因為它們能夠在培養中無限增殖，并因此能夠為替代失效的或有缺陷的人體組織提供細胞和組織。在未來，很高的期望在于人類ESCs將會增殖和定向分化成特定的細胞類型，所述特定的細胞類型能夠移植到人體中用于治療目的或者用作藥物發現和毒理學研究中的細胞模型。胚胎干細胞是難以在培養中維持，因為它們傾向于遵循其自然的細胞命運，并自發地分化。大多數的培養條件導致一定水平的不必要的分化。干細胞分化是由于許多內在和外在因素，所述因素包括生長因子、細胞外基質分子和成分、環境應激源和直接的細胞-細胞間的相互作用。長期的增殖能力、經過持久培養后多潛能發育潛能以及核型穩定性是有關干細胞培養實用性方面的關鍵特征。hESCs的未分化階段能夠通過判斷細胞的形態特征來監控。未分化的hESCs具有非常小而緊湊的細胞的特征形態。而一些分化的細胞通常出現在hESCs集落的邊緣，最佳的培養方法提供了具有最少量的分化細胞的生長支持。有幾個生化標記物用于追蹤hESCs分化階段的狀態，所述生化標記物如轉錄因子0ct4和Nanog，以及作為細胞表面標記物TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3/4。當hESCs開始分化成任意細胞系時，這些標記將丟失。創建和培養hESCs的基本技術已被描述。然而，對于目前用于培養hESCs的許多程序而言，存在著限制和缺點。典型地，胚胎干細胞已經在含有動物血清(特別是胎牛血清)或其它動物衍生產品的培養基中衍生和增殖，以允許在該培養過程中所需的增殖。hESC培養基中的動物衍生產品的存在有幾個問題。首先，動物衍生產品可能含有引發接受者的免疫應答的毒性蛋白質或免疫原，并因此導致對移植的排斥(Martin等人，Nat Med. 2005Feb ；11(2) :228-32)。其次，動物產品的使用增加了受到動物病原體(如病毒、支原體和朊病毒)污染的風險，這可能會造成細胞治療和其他臨床應用中嚴重的健康風險(Healy等人，AdvDrug Deliv Rev. 2005 Dec 12 ;57 (13) : 1981-8)。事實上，政府機構正在越來越多地調控、勸阻甚至禁止含有動物衍生產品(其可能含有該病原體)的細胞培養基的使用。第三，細胞培養物中不確定的成分危害到細胞模型實驗的重復性，例如在藥物發現和毒理學研究中。為了克服使用血清或動物提取物的缺點，已經開發了一些無-血清的培養基。Price等人在美國專利申請2002/0076747中公開了血清替代物，在hESC培養中頻繁使用的Knockout SR培養基(Invitrogen公司，卡爾斯巴德,加利福尼亞州)。然而，這種制劑含有動物衍生產品，如牛血清白蛋白，因此并不是完全不含異源物衍生化成分的。目前可獲得幾種不含異源物的血清替代物和培養基(X-Vivo 10、X-Vivo 20、SSS、Lipumin, Serex,Plasmanate、SR3)。這些血清替代物通常是特殊調配的以支持單一細胞類型的培養。此外，Thomson等人在美國專利申請2006/0084168中公開了無-血清并且不含異源物的細胞培養基，據稱其支持培養中ESCs的生長。不幸地，Rajala等人在 Hum. Reprod.，2007, 22 (5) : 1231-1238 中指出，所有上述制劑僅僅允許hESCs培養在對于新培養基的適應階段過程中傳代數次而不發生嚴重的分化，在后續的傳代中迅速分化。國際專利申請公布W02008/148938公開了不含異源物的血清替代物，其包含視黃醇和包含用于ESCs維持和衍生的所述血清替代物的培養基。然而，仍然需要有用于培養多潛能(pluripotent)和多能(multipotent)干細胞的改進的不含異源物的制劑。已經開發了幾種用于hESCs的不含飼養層(feeder)的培養方法。這些不含飼養層的方法中的許多種利用了動物衍生成分。此外，這些方法遭受重現性不足的影響，并且目前無法用于具有穩定和正常的核型的未分化的hESCs的長期維持。對于hESCs而言，采用酶傳代的不含飼養層的培養也可能是苛刻的以至于它們變得更加傾向于異常。 因為這些問題與目前已知的用于hESCs的培養基有關，迫切需要一種確定的不含異源物的培養基，其可重現地長期支持hESCs的茁壯生長不發生本質的分化而是維持多潛能性以及正常的細胞核型，并且這與管理臨床安全性和有效性的預期監管準則以及用于在藥物發現和毒理學驗證中所使用的體外細胞模型的標準化方法相兼容。
技術實現思路
本專利技術提供了用于臨床-級干細胞衍生、維持和分化的手段和方法。更具體地，本專利技術涉及血清替代物、包含所述血清替代物的最終培養基及其用途。本專利技術的一個目的在于提供一種不含異源物的血清替代物，其包含至少一種選自共軛亞油酸和二十碳五烯酸的脂肪酸。在一些實施方案中，共軛亞油酸(CLA)的濃度是如此的，以至于最終培養基包含從大約O. 5mg/l至大約5mg/l的CLA,并且二十碳五烯酸(EPA)的濃度是如此的，以至于最終培養基包含從大約lmg/1至大約10mg/l的EPA，所述最終培養基是補充有所述血清替代物的基礎培養基。在一些實施方案中，血清替代物可以進一步包含活化素A和/或視黃醇。在一些其他的實施方案中，活化素A的濃度是如此的，以至于最終培養基包含從大約O. 001mg/l至大約O. 02mg/l的活化素AJP /或視黃醇的濃度是如此的，以至于最終培養基包含從大約O. 25mg/l至大約I. Omg/1的視黃醇。在另外一些其他的實施方案中，血清替代物可以進一步包含硬脂酸。在一些其他的實施方案中，硬脂酸的濃度是如此的，以至于最終培養基包含從大約O. 5mg/l至大約5mg/l的硬脂酸。本專利技術的另一個目的在于提供一種不含異源物的細胞培養基，細胞培養基包括基礎培養基和根據本專利技術的實施方案的血清替代物。本專利技術的另一個目的涉及本血清替代物或細胞培養基用于干細胞維持、增殖或分化的用途。此外，本專利技術的目的涉及本血清替代物或細胞培養基用于干細胞衍生或分離的用途。本專利技術的另一個目的在于提供一種用于在體外初始化(initiate)新干細胞的方法。所述方法包含a)提供所需來源的分離的干細胞，b)用本專利技術的不含異源物的培養基接觸所述細胞，和c)在適合于干細胞培養的條件下培養所述細胞。在一些實施方案中，培養可以在飼養細胞層上進行。在一些實施方案中，所述分離的細胞是胚胎來源的、成人軀體來源的或間葉細胞來源的。本專利技術的另一個目的在于提供一種用于培養干細胞的方法。所述方法包含a)用本專利技術的不含異源物的培養基接觸所述干細胞，和b)在適合于干細胞培養的條件下培養所述細胞。在一些實施方案中，培養可以在飼養細胞層上進行。本專利技術的培養基能夠支持干細胞以基本上未分化的狀態體外傳代數次的維持和增殖。此外，在根據本專利技術的培養基中培養的干細胞是基本上未分化的，保留其多潛能性或多能性并且維持其基因組完整性。另外，本專利技術的一個目的在于提供一種用于分化干細胞的方法。所述方法包含a)采用補充有致分化劑，如生長因子或本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：K·拉亞拉，R·M·塞佩寧，O·霍瓦塔，H·斯科特曼，
申請(專利權)人：K·拉亞拉，R·M·塞佩寧，O·霍瓦塔，H·斯科特曼，
類型：
國別省市：