一種干細胞制劑及其制備方法和應用技術

本發(fā)明專利技術涉及生物治療領域，公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，所述干細胞制劑對肝硬化有良好的療效。本發(fā)明專利技術公開的干細胞制劑，包括：間充質(zhì)干細胞制劑和免疫細胞制劑。本發(fā)明專利技術公開了所述干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：a)、間充質(zhì)干細胞、白蛋白和溶劑混合，得到所述間充質(zhì)干細胞制劑；b)、免疫細胞和溶劑混合，得到所述免疫細胞制劑。本發(fā)明專利技術還公開了所述干細胞制劑或所述制備方法制得的干細胞制劑在制備治療肝硬化藥物中的應用。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及生物治療領域，特別涉及一種干細胞制劑及其制備方法和應用。
技術介紹
間充質(zhì)干細胞是多能干細胞的一種，具有多向分化的潛能，在體外誘導的條件下可以分化為肌肉、神經(jīng)、骨、軟骨、脂肪、心肌和類肝組織等多種組織和細胞。在長期傳代后仍然具有增殖復制能力，是一種理想的組織器官工程的種子細胞。目前在臨床上也有越來越多的人使用間充質(zhì)干細胞應用于組織器官的修復和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。淋巴細胞(lymphocyte)也稱淋巴球，是白細胞的一種，由淋巴器官產(chǎn)生，是機體免疫應答功能的重要細胞成分。淋巴細胞包括T細胞、B細胞和NK細胞等亞類，分別介導機體的細胞免疫、體液免疫和對腫瘤細胞和病毒感染細胞的殺傷作用等免疫學功能。由于肝硬化患者體內(nèi)免疫功能亢進，間充質(zhì)干細胞回輸后僅能維持較短時間，需要頻繁回輸以達到治療目的，并且在很多情況下并不能控制病情發(fā)展，治療效果有限。因此，研究一種對肝硬化具有良好療效的間充質(zhì)干細胞制劑是本領域技術人員需要解決的技術問題。
技術實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，所述干細胞制劑對肝硬化有良好的療效。本專利技術公開了一種干細胞制劑，包括：間充質(zhì)干細胞制劑和免疫細胞制劑；所述間充質(zhì)干細胞制劑包括：間充質(zhì)干細胞、白蛋白和溶劑；所述免疫細胞制劑包括：免疫細胞和溶劑。在本專利技術的一些技術方案中，所述間充質(zhì)干細胞的含量為1×105～1×107個/ml。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細胞的含量為1×106個/ml。在本專利技術的一些技術方案中，所述白蛋白含量為1％～8％(w/v)。優(yōu)選地，所述白蛋白的含量為3％(w/v)。在本專利技術的一些技術方案中，所述免疫細胞的含量為1×105～1×107個/ml。優(yōu)選地，所述免疫細胞的含量為5×106個/ml。優(yōu)選地，所述免疫細胞為淋巴細胞。優(yōu)選地，所述溶劑為生理鹽水。本專利技術還公開了所述干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：a)、間充質(zhì)干細胞、白蛋白和溶劑混合，得到所述間充質(zhì)干細胞制劑；b)、免疫細胞和溶劑混合，得到所述免疫細胞制劑。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細胞按照以下步驟獲得：c1)、將骨髓進行離心分離，得到原代間充質(zhì)干細胞；c2)、重懸所述原代間充質(zhì)干細胞，進行培養(yǎng)；c3)、換液除去未貼壁細胞，加入培養(yǎng)基繼續(xù)對所述原代間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)；c4)、對培養(yǎng)的細胞進行消化，得到所述間充質(zhì)干細胞。優(yōu)選地，所述免疫細胞按照以下步驟獲得：d1)、將臍血進行離心分離，取中間白膜層；d2)、將所述白膜層接種到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；d3)、收集培養(yǎng)的細胞，得到所述免疫細胞。本專利技術還公開了所述干細胞制劑或所述制備方法制得的干細胞制劑在制備治療肝硬化藥物中的應用。綜上所述，本專利技術公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，該干細胞制劑包括間充質(zhì)干細胞制劑和免疫細胞制劑，通過將間充質(zhì)干細胞制劑和免疫細胞制劑進行混合回輸，可以誘導患者免疫耐受，從而使間充質(zhì)干細胞不會受到免疫排斥，存活時間更長，效果維持的時間也更久，對肝硬化具有良好的療效。附圖說明圖1示1周后實驗組、對照組和對比例組的細胞數(shù)；圖2示4周后實驗組、對照組和對比例組的細胞數(shù)；圖3示8周后實驗組、對照組和對比例組的細胞數(shù)；圖4示1周后實驗組、對照組和對比例組的血清學檢測結果；圖5示4周后實驗組、對照組和對比例組的血清學檢測結果；圖6示8周后實驗組、對照組和對比例組的血清學檢測結果。具體實施方式本專利技術公開了一種干細胞制劑及其制備方法和應用，該干細胞制劑能誘導患者免疫耐受，對肝硬化具有良好的療效。本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本專利技術。本專利技術的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
技術實現(xiàn)思路
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本專利技術技術。本專利技術中所涉及原料均可由市場購得。其中，白蛋白購買自鄭州萊士。下面結合實施例，進一步闡述本專利技術。實施例1間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和干細胞制劑的制備1、取無菌條件下抽取的小鼠骨髓10ml，加入等體積的DMEM-LG培養(yǎng)基(購買自gibco)稀釋混勻后，1000r/min離心5min，去除上層的脂肪及上清；2、用含10％FBS和1×雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細胞，并調(diào)整細胞密度為5×105/ml接種到15cm培養(yǎng)皿中，轉移至5％CO2、37℃、飽和濕度為95％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3、培養(yǎng)48h后換液除去未貼壁雜細胞，此后每隔2～3d換液1次；4、待細胞數(shù)達到1×108個后，將1/10細胞培養(yǎng)基體積的Hoechst染料溶液(購買自江蘇凱基生物)加入細胞培養(yǎng)物中，在37℃培養(yǎng)細胞10～20分鐘。5、棄去上清液，用PBS或合適的緩沖液洗細胞兩次。加入8ml0.25％(質(zhì)量體積比)的胰酶(購買自sigma)消化細胞；5、待細胞變圓松動后，加入兩倍于胰酶體積的含10％FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基終止消化；6、倒出細胞懸液，離心棄去上清，生理鹽水清洗2遍，得到用于制備干細胞制劑的間充質(zhì)干細胞(間充質(zhì)干細胞表型鑒定為CD90+＞95％，CD73+＞95％，CD105+＞95％，CD45+＜0.2％，CD34+＜0.2％)；7、用含有3％白蛋白的生理鹽水重懸步驟6制備的間充質(zhì)干細胞，使細胞密度為5×106個/ml，制成干細胞制劑注射液。實施例2免疫細胞的分離培養(yǎng)和免疫細胞制劑的制備1、取10ml臍血，添加等體積的生理鹽水稀釋，稀釋液添加至Ficoll分離液(按照稀釋后的臍血體積的三分之一添加Ficoll分離液)，700g離心20-30min，升降速降為零，吸取中間白膜層；2、將白膜層用生理鹽水清洗兩遍，對白膜層的細胞進行計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果加入含有10％FBS、20ng/mlIL-2的1640培養(yǎng)基，調(diào)整接種密度為1×106個/ml，放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3、之后按照細胞數(shù)量補充含有10％FBS、20ng/mlIL-2的1640培養(yǎng)基，保持細胞密度在1×106個/ml；5、收集培養(yǎng)到14天的免疫細胞(流式鑒定為CD3+和CD56+＞40％)用生理鹽水重懸細胞密度為5×106個/ml，總共需要1ml的細胞懸液。實施例3動物試驗將購買自廣東省醫(yī)學動物實驗中心的肝硬化模型的36只昆明小鼠分為三組。組1為治療組，治療組用實施2制備的免疫細胞制劑0.2ml每次、多點注射(每次注射0.2ml，是注射5次共1ml)于小鼠的皮下，總共注射1ml。24小時后通過尾靜脈注射1ml實施例1制備的干細胞制劑，每天注射一次，連續(xù)注射3天。組2為對照組，對照組用生理鹽水0.2ml每次、多點注射于小鼠的皮下，總共注射1ml。24小時后通過尾靜脈注射1ml生理鹽水，每天注射一次，連續(xù)注射3天。組3為對比例組，通過尾靜脈注射實施例1制備的干細胞制劑1ml，每天注射一次，連續(xù)注射3天。在治療后1周、4周、8周每組各隨機選取2只小鼠，抽血通過Elisa試劑盒檢測AST、ALT指標(試劑盒購買自南京金益柏生物科技有限公司)，然后處死取肝部組織制作石蠟切片，熒光顯微鏡下觀察計數(shù)Hoechst熒光染料在該部位的細胞染色情況。1周后細胞數(shù)見表1、本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種干細胞制劑，其特征在于，包括：間充質(zhì)干細胞制劑和免疫細胞制劑；所述間充質(zhì)干細胞制劑包括：間充質(zhì)干細胞、白蛋白和溶劑；所述免疫細胞制劑包括：免疫細胞和溶劑。

【技術特征摘要】
1.一種干細胞制劑，其特征在于，包括：間充質(zhì)干細胞制劑和免疫細胞制劑；所述間充質(zhì)干細胞制劑包括：間充質(zhì)干細胞、白蛋白和溶劑；所述免疫細胞制劑包括：免疫細胞和溶劑。2.根據(jù)權利要求1所述的干細胞制劑，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞的含量為1×105～1×107個/ml。3.根據(jù)權利要求1所述的干細胞制劑，其特征在于，所述白蛋白含量為1％～8％(w/v)。4.根據(jù)權利要求1所述的干細胞制劑，其特征在于，所述免疫細胞的含量為1×105～1×107個/ml。5.根據(jù)權利要求1所述的干細胞制劑，其特征在于，所述溶劑為生理鹽水。6.權利要求1至5任意一項所述的干細胞制劑的制備方法，包括以下步驟：a)、間充質(zhì)干細胞、白蛋白和溶劑混合，得到所述間充質(zhì)干細胞制劑...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：葛嘯虎，陳海佳，王一飛，萬樺，張維敏，
申請(專利權)人：廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44