水曲柳懸浮培養體系的建立方法技術

本發明專利技術提供了一種水曲柳懸浮細胞體系的建立方法，1）以水曲柳莖段作為外植體，誘導愈傷組織，在添加激素TDZ和BA、蔗糖、瓊脂的WPM固體培養基上獲得愈傷組織；2）將步驟1）中得到的愈傷組織接種到添加激素BA和2,4-D、蔗糖的WPM液體培養基中，振蕩培養。3）培養10-15d繼帶一次，連續繼帶培養3-5個繼帶，獲得生長均勻、快速增殖的懸浮細胞系。本發明專利技術具有繁殖速度快、培養規模大和提供大量均勻植物細胞培養物的特點。

【技術實現步驟摘要】

一種利用基本培養基和附加不同激素成份對，本專利技術屬于植物細胞工程

技術介紹
水曲柳(Fraxinusm andshu rica.)屬于木犀科白臘樹屬，是一種高大落葉喬木，為我國東北珍貴的“三大硬闊”之一，木材材質優良，紋理美觀，廣泛應用于各領域。國外已有研究發現其樹皮中含有香豆素類成分，包括秦皮甲素(Esculin)，秦皮乙素(Esculetin),秦皮苷(Fraxin),異秦皮定(Isofraxidin),白臘樹精(Mandshurin, Fraxinol) 0香豆素類化合物不僅能直接抑制癌細胞，而且可以通過增 強機體免疫力產生抗癌作用。但目前香豆素類化合物主要來自于木樨科白蠟樹樹皮和葉中，這極大的造成了資源的浪費和破壞，不利于可持續發展。如果能運用細胞工程手段，利用細胞大量培養及代謝產物分離，提高水曲柳中香豆素類物質含量，同時避免季節性對生產帶來的影響，這將對水曲柳中香豆素的生產與利用具有重要的意義。以單細胞或小細胞團作為對象進行水曲柳細胞、基因工程等研究具有很大優勢，因為單細胞或小細胞團受周圍細胞和微環境影響較小，而且遺傳上比較穩定；生長速度快，通過生物技術手段對再生植株進行選擇，可大大縮短育種年限。目前，對水曲柳組織培養研究主要通過嫩莖尖直接再生苗、休眠冬芽萌動、種子直接發芽。而利用愈傷組織再生及懸浮細胞培養還未見報道。
技術實現思路
本專利技術目的是在于提供一種水曲柳懸浮體系建立的方法，方法易行，操作方便，增殖速度塊，可加快水曲柳的快速繁殖。為達到上述目的，本專利技術采用以下技術措施I.以水曲柳葉柄作為外植體，用75%酒精浸泡10-30s，用O. 1%的Ca(ClO)2處理2-5min，用無菌水沖洗3_6次；2.將消毒好的葉柄在培養皿中用無菌刀切割成O. 5_2cm左右的小段，接種于固體培養基中，培養基的有效成分為=WPM培養基和附加成份，附加成份為TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 瓊脂 5000_8000mg/L+ 蔗糖 2%_3% ；3.光照培養，溫度25_28°C，每天光照10_16h，培養10_30d ；4.將誘導出的愈傷組織用無菌刀切成O. 4-0. 8cm,接種到含有30_50mL液體培養基的100-150mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織30-50塊，置于轉速為100_130r/min的搖床上，溫度25-28°C，每天光照10-16h，培養10_15d繼代一次。培養及成份為WPM培養基和附加成份，附加成份為BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+蔗糖2%-3%。WPM培養基的成份(單位mg/L)大量元素①NH4NO3400②KH2PO4170③MgS04.7H20370④K2SO4990 鈣鹽①Ca (NO3) 2 · 4H20556②CaCl2 · 2H2096微量元素①Na2MoO4 · 2H20O. 25②MnSO4 · H2O22. 5③ZnSO4 · 7H208. 6④CuSO4 · 5H20O. 25⑤H3BO36. 2鐵鹽①FeSO4 · 7H2027. 8②Na2-EDTA37. 3有機物①肌醇100②維生素BII. O③煙酸O. 5④維生素B6O. 5⑤甘氨酸2. O⑥肌醇100本專利技術主要具有以下幾方面的優點I.生產成本低，可實現工業化生產本專利技術以液體作為培養基，去除瓊脂，本專利技術方法的成本相比于傳統的固體培養技術有顯著降低，可實現工業化生產。2.細胞繁殖速度快采用本專利技術細胞細胞懸浮培養方法，水曲柳可在15-20d獲得大量單細胞和細胞團，可用于生物反應器培養，可大大提高繁殖率，繁殖率可達10倍以上。附圖說明圖I水曲柳懸浮細胞系側面觀察2水曲柳懸浮細胞系底部觀察圖具體實施例方式本專利技術的目的在于提供了一種，方法易行，操作方便，增殖速度快，可加快水曲柳的快速繁殖。為了達到上述目的，本專利技術采用以下技術措施I.以水曲柳莖段作為外植體，用75%酒精浸泡IOs或20s或25s或28s或30s，用O.1%的Ca (ClO) 2處理2min或3min或5min，用無菌水沖洗3次或4次或5次或6次；2.將消毒好的莖段在培養皿中用無菌刀切割成O. 5-2cm左右的小段，接種于固體培養基中，培養基的有效成分為=WPM培養基和附加成份，附加成份為TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 瓊脂 5000_8000mg/L+ 蔗糖 2%_3% ；3.光照培養，溫度25_28°C，每天光照10_16h，培養10_30d ；4.將誘導出的愈傷組織用無菌刀切成O. 4-0. 8cm,接種到含有30_50mL液體培養基的100-150mL的三角瓶中，每瓶接種愈傷組織30-50塊，置于轉速為100_130r/min的搖床上，溫度25-28°C，每天光照10-16h，培養10_15d繼代一次。培養及成份為WPM培養基和附加成份，附加成份為BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+蔗糖 2%-3% ；5.連續繼代培養3-5次，獲得生長均勻穩定的細胞系。權利要求1.一種水曲柳(Fraxinusm andshu rica.)愈傷組織細胞懸浮體系的培養方法,包括以下步驟(I)水曲柳的外植體消毒后接種在啟動培養基上，得到愈傷組織；(2)將步驟(I)所得島的無菌愈傷組織，切成小塊，接種到液體培養基中；(3)置于搖床上振蕩、光照培養；(4)繼代培養后可得到懸浮細胞系。2.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的水曲柳外植體為水曲柳的莖段。3.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的消毒方式是用75%酒精浸泡10-30s，用O. 1%的Ca(ClO)2處理2_5min，用無菌水沖洗3-6次。4.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的啟動培養基的組成為WPM+TDZ O. 1-1. Omg/L+NAA O. 5-2. Omg/L+ 瓊脂 5000-8000mg/L+ 蔗糖 2%_3%。5.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的液體培養基的組成為WPM+BA O. 05-0. 5mg/L+2, 4-D O. 1-1. Omg/L+ 蔗糖 2%_3%。6.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的振蕩、光照培養條件為搖床轉速為100-130r/min，溫度25_28°C，每天光照10_16h。7.按照專利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的繼代培養時間為10-20d繼代一次，連續繼代培養3-5次。全文摘要本專利技術提供了一種水曲柳懸浮細胞體系的建立方法，1)以水曲柳莖段作為外植體，誘導愈傷組織，在添加激素TDZ和BA、蔗糖、瓊脂的WPM固體培養基上獲得愈傷組織；2)將步驟1)中得到的愈傷組織接種到添加激素BA和2,4-D、蔗糖的WPM液體培養基中，振蕩培養。3)培養10-15d繼帶一次，連續繼帶培養3-5個繼帶，獲得生長均勻、快速增殖的懸浮細胞系。本專利技術具有繁殖速度快、培養規模大和提供大量均勻植物細胞培養物的特點。文檔編號C12N5/02GK102888379SQ2012104371本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種水曲柳（Fraxinusm？andshu？rica.）愈傷組織細胞懸浮體系的培養方法，包括以下步驟：(1)水曲柳的外植體消毒后接種在啟動培養基上，得到愈傷組織；(2)將步驟(1)所得島的無菌愈傷組織，切成小塊，接種到液體培養基中；(3)置于搖床上振蕩、光照培養；(4)繼代培養后可得到懸浮細胞系。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：齊鳳慧，詹亞光，曾凡鎖，
申請(專利權)人：東北林業大學，齊鳳慧，詹亞光，
類型：發明
國別省市：