分離高純度細胞群體的生理學方法技術

本公開提供用于分離源自干細胞的純的或富集的分化細胞群體的方法，包括分化干細胞群體；和遷移分化細胞通過分化設備中的多孔膜，以分離純的或富集的分化細胞群體。本公開也提供用于分離源自干細胞的純的或富集的分化細胞群的分化設備，設備包含多孔膜；和胞外基質。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】分離高純度細胞群體的生理學方法
本公開總體上涉及干細胞的領域，并且更具體地涉及分離源自干細胞的純的或富集的分化細胞群體的方法和設備。
技術介紹
人多能干細胞，包括人胚胎干細胞(hESC)、人孤雌生殖干細胞(hpSC)和人誘導多能干細胞(hiPSC)能夠無限復制并且分化成所有3個胚層：內胚層、中胚層和外胚層的衍生物。因此，人多能干細胞的分化能力具有很大的希望用于治療性應用。高純度治療性細胞的衍生是再生醫學的一個主要目標。hESC源自早期胚胎的胚細胞的內細胞團。相比之下，hpSC和hiPSC二者避免該倫理考慮。第一策劃產生的hpSC源自由化學刺激物活化的未受精卵母細胞的胚泡的內細胞團。hpSC，像hESC經歷廣泛的自我更新并且具有體外和體內的多能分化能力。通過誘導特定基因的“強迫”表達，hiPSC人工源自非多能細胞，典型地成體體細胞。hpSC的產生克服了與hESC相關的倫理障礙，因為hpSC的衍生起源于未受精的卵母細胞。iPSC首先于2006年從小鼠細胞并且于2007年從人細胞中產生。除了倫理考慮，hiPSC也避免植入物抗宿主疾病和免疫排斥問題，因為不像hESCs，它們全部源自患者。多能干細胞的兩個有希望的應用包括細胞置換療法，用于糖尿病和慢性肝病。高純度DE的產生是產生治療上有用DE譜系細胞——包括肝細胞和胰內分泌細胞的關鍵的第一步。DE在原腸胚期間由外胚層細胞形成，所述外胚層細胞經歷上皮-至-間充質轉換(EMT)并且內移通過胚胎原條。當由來自環境的分化信號發射時，外胚層的上皮樣細胞經歷多個形態學和生物化學變化，這使能夠它們呈現間充質細胞表型。該表型包括細胞內粘著復合物的破壞和上皮細胞頂端-基底極性的丟失。這些細胞骨架變化允許這些細胞離開上皮并開始遷移。EMT的完成通過間充質細胞遷移離開起始的上皮層發信號。一旦形成，經內移起作用的原條產生中內胚層，其隨后分離形成中胚層和內胚層。使用高水平激活素A和Wnt3a信號以模擬細胞在內移期間原條處接收的信號，在體外DE已經由hESC、hpSC和hiPSC得到。但是，關于指導干細胞向DE的主要分化信號的知識還未翻譯為方法以分化高純化的DE而在培養物中沒有未分化細胞污染。為了臨床應用，這些殘留的未分化細胞是主要的安全性考慮，因為它們可產生畸胎瘤。例如，在注入產自hESC的DE衍生物的未純化胰臟培養物之后，46只小鼠中的7只發展了畸胎瘤。此外，從分化的第一階段殘留的未分化細胞可能顯著減小全分化過程的效率。從hESC得到肝細胞樣細胞的最先進方案之一產生估計的18-26%的效率，并且分化的肝細胞的富集需要流式細胞計數步驟(產生其中55%的細胞表達白蛋白的群體)。數個小組已經解決了分化的DE的細胞純度的問題，認識到不存在未分化細胞產生的DE的重要性。通過含有高劑量激活素A、骨形態形成蛋白-4(BMP4)、成纖維細胞生長因子-2(FGF2)和PI3K化學抑制劑的確定成分培養基實現最好的結果，但是，多能性標記物比如OCT4和NANOG在最終分化細胞產物中是可檢測的。所有之前的研究使用二維(2D)培養系統(塑料平皿上的單層培養物)并且不提供基質以促進中內胚層遷移。二維(2D)培養系統也不能容易地呈現生理學有關的三維(3D)ECM環境，其提供在原腸胚形成期間用于遷移的關鍵信號和底物。因此，本領域仍需要用于分化和純化DE的新方法和設備。
技術實現思路
本公開解決了這些需要并且主要通過提供用于分離源自干細胞的純的或富集的分化細胞群體的新方法和設備解決了這些需要，其通過如下步驟進行：分化干細胞群；并且使分化細胞遷移通過分化設備中的多孔膜以分離純的或富集的分化細胞群。本公開也提供分化設備，用于分離源自干細胞的純的或富集的分化細胞群，該設備包括多孔膜；和胞外基質。基于脊椎動物胚胎發育過程的特征，本公開還提供新方法和設備用于提供高純度DE，其利用DE祖細胞，例如，hESC、hpSC和hiPSC的遷移能力。所公開的方法和設備使用并入與三維(3D)ECM結合的多孔膜的設備來模擬轉變通過原條的胚胎發育過程。已經發現，在膜上未分化的hESC、hpSC或hiPSC的處理導致EMT。一旦處理，響應的細胞獲得間充質表型和遷移通過膜中的孔進入三維ECM的能力，在那里這些細胞分化成DE。如使用免疫細胞化學和流式細胞術通過OCT4表達評估的，已經發現得到的DE是高純化的并且未被未分化細胞污染。也已發現這些過程保留了DE的功能性質。例如，所公開的設備中分化的DE可產生高度富集的肝細胞樣細胞(HLC)的群體，其特征為肝系標記物的表達，包括甲胎蛋白、轉甲狀腺素蛋白(TTR)、肝細胞核因子4α(HNF4α)、細胞角蛋白18、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶(AAT1)、CYP3A7、CYP3A4、CYP7A1、CYP2B6、鳥氨酸轉氨甲酰酶(OTC)和苯丙氨酸羥化酶(PAH)；和具有的與人肝細胞關聯的功能，比如ICG攝取和釋放、糖原貯積(PAS測試)、可誘導的細胞色素P450活性(PROD試驗)和移植進免疫缺陷小鼠后植入肝臟中。所公開的方法和設備也是廣泛可應用的，并且純化的DE可使用hESC，以及數個hpSC系獲得。所公開的方法和設備表示朝著有效生產源自DE的高純度細胞，包括肝細胞和胰內分泌細胞的重要步驟，用于再生醫學和藥物發現，以及用作研究發育期間細胞命運特化和行為的平臺，包括闡明原腸胚形成期間細胞內移和在細胞命運特化的根本機制。因此，在一種實施方式中，本公開提供用于分離來自多能干細胞群高純度DE的體外方法，如下進行：a)使多能干細胞群與一種或多種分化信號接觸，其模擬上胚層的上皮樣細胞在原條的內移期間接收的信號；b)通過允許接觸的細胞經歷EMT使它們分化，以產生具有間充質表型的細胞；c)允許具有間充質表型的分化細胞遷移通過多孔膜進入三維ECM；和d)允許三維ECM中遷移的細胞分化成高純度DE。在其他實施方式中，本公開提供分離來自多能干細胞群體高純度DE的設備，其包括：多孔膜；和三維ECM。附圖簡述圖1A-1D圖解了在體內和體外兩種條件下細胞在DE分化期間的遷移。A)體內：在原腸胚形成期間細胞遷移通過原條的示意圖。B)體外：刺激遷移通過原條的3D-分化設備的示意圖。C)石蠟包埋的、3D-分化系統切片的蘇木素和曙紅染色表明在分化3天之后3D-分化系統中細胞的2個區室，一個群體在膜上一個在膜下。D)石蠟包埋的、3D-分化系統切片的免疫熒光標記表明位于膜下方的DE細胞的身份(SOX17-陽性細胞核，綠色)不同于位于膜上方分化的和未分化的(OGT4-陽性細胞核，紅色)細胞的混合物。圖2A-2F圖解了在分化信號下，多能干細胞經歷EMT和獲得遷移的能力。A)RT-qPCR顯示在hpSC分化期間E-鈣粘著蛋白表達的下調和N-鈣粘著蛋白表達的上調。dO表示獲自細胞的結果，所述細胞在誘導分化之前收集自多孔膜上方。B)未分化的和分化的培養物的免疫熒光標記表明在應用分化信號(Oh)之前在未分化細胞中存在E-鈣粘著蛋白表達和在開始分化方案72小時之后(72h)在從三維ECM收集的細胞中缺少E-鈣粘著蛋白表達。C)分化的培養物的免疫熒光標記表明在開始分化方案24小時之后，從三維ECM收集的細胞中N-鈣粘著蛋白的表達。D)相位差和間接免疫熒光顯微鏡本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.04.20 US 61/326,084;2010.05.18 US 61/345,9491.在分化設備中分離源自多能細胞的純的或富集的分化細胞群體的體外方法，所述方法包括使用激活素A信號和Wnt3a信號分化多能細胞，從而使所述多能細胞經歷上皮-至-間充質轉換(EMT)以產生具有間充質表型的細胞；允許具有所述間充質表型的細胞遷移通過具有接種有多能細胞的上側的多孔膜并且進入包括三維胞外基質(ECM)的下側；和使用激活素A信號和Wnt3a信號允許所述三維ECM中的遷移的細胞分化成高純度定形內胚層(DE)，以及其中所述高純度DE以大于90％的純度分離，其中所述多能細胞不是源自人胚胎，其中所述激活素A和Wnt3a信號模擬細胞在原條內移期間接收的TGF-β和Wnt信號，并且其中所述多孔膜具有從5微米至12微米的任何大小的孔。2.權利要求1所述的方法，其中細胞遷移包含趨化性遷移或通過所述分化設備的結構性能或組件布置而誘導的遷移。3.權利要求1所述的方法，其中所述DE用于治療或研究目的。4.權利要求3所述的方法，其中所述治療用途包括糖尿病、視網膜病、心臟病或肝臟疾病治療。5.權利要求1所述的方法，其中多能細胞選自胚胎干細胞系、誘導多能干細胞、分離自器官和組織的成體干細胞、分離自臍帶血的干細胞、分離自毛囊的干細胞、間充質干細胞，神經元干細胞和癌干細胞。6.權利要求1所述的方法，其中所述多能細胞是哺乳動物多能細胞。7.權利要求1所述的方法，其中所述多孔膜包括任一高表面積支架，所述高表面積支架包括由下述組成的一種或多種多孔二維或三維膜或海綿體：聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或碳酸鈣。8.權利要求1所述的方法，其中所述多孔膜包括接種有多能細胞的上側和下側，所述下側包括胞外基質，所述胞外基質包括人或非人膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、包含硫酸肝素的蛋白聚糖、硫酸軟骨素、硫酸角質素、包含透明質酸的非蛋白聚糖多糖。9.權利要求1所述的方法，其中所述多孔膜包括接種有多能細胞的上側，其包括纖維結構；海綿體；網狀結構；生長因子的分子，所述生長因子的分子包括TGF家族蛋白、激活素A、各種FGF、各種BMP、HGF、KGF、OSM；或各種類型的粘附活細胞，所述粘附活細胞以二維或三維模式或其組合布置在所述多孔膜上。10.權利要求9所述的方法，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：N·托洛維茨，A·賽麥金，L·阿加波娃，J·杰尼斯，
申請(專利權)人：國際干細胞公司，
類型：
國別省市：