一種基因點突變的實時PCR檢測方法及其應用技術

本發明專利技術屬于基因突變檢測領域，具體涉及一種基因點突變的實時PCR檢測方法及其應用。該方法包括以下步驟：(1)實時PCR的DNA擴增循環程序；(2)解鏈曲線分析程序，(3)判定所測基因有無突變；其中雙探針，所述上游探針的尾端接一個Fluorescein，所述下游探針的頭端標記一LC熒光色團，雙探針之一覆蓋突變點，突變點和雙雜交探針在引物的下游盡量靠近另一個引物；本發明專利技術重復性好，筒單，快速，只需很少量的DNA樣品(2-3ng)，特別適用于大量樣品檢測，本方法的另外一個最重要的特點是不會引起PCR產物的污染，可以極大地降低運作成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及一種基因點突變的檢測方法。
技術介紹
隨著人類基因圖譜草圖的公布和各種病原體基因序列的揭示，這都將極大的促進疾病相關基因的結構和功能研究，特別是基因缺失、錯位、突變(有義突變)等與疾病的關系。在眾多導致人類疾病的基因有義突變、病原體亞型以及耐藥基因的有義突變中，單堿基突變占了相當大的比例，其檢測方法的探索一直是基因診斷研究中的重要課題，特別是對已知有義突變的檢測，將是臨床進行基因診斷的重要手段之一。PCR擴增技術問世以來，建立于擴增基礎上的突變檢測技術使檢測靶DNA(目的DNA)含量和/或突變靶序列比例過低、檢測靈敏度不足等難題得以克服，使得分子診斷技術進入了新階段。在過去十多年中，曾出現了多種點突變的檢測方法。1.經典的PCR-RFLP等點突變的檢測方法。RFLP連瑣分析技術是最早用于分析已知點突變的方法，其檢測特點是:具有較高的特異性，可以確定突變的部位及性質，重復性好。但不足之處是僅適合于多態性的檢測:即突變頻率大于I %才能被檢測到；因此，RFLP分析對于檢測突變的早期，尤其是在野生型遠多于突變型時其敏感性就顯得不足了。2.反向限制性位點突變分析(iRSM):在RFLP分析之前用另一種內切酶對靶序列進行消化，減少了野生型序列的含量(一般消化率> 99% )，因而大大提高了突變序列的檢出率。但是，由于聚合酶的關系，可能在PCR擴增后導致iRSM分析出現假陽性。3.基因芯片具有檢測信息高通量和自動化程度高，一次性檢測可檢出多個位點突變，具有很大的發展潛力，但制備技術要求高。 4.DNA 測序Sanger DNA測序是點突變檢測的金標準。但Sanger測序靈敏度低，測序準備時間長。另一個方法是焦磷酸測序，它的特點是準備時間短，測序也快。但是這兩種方法都需要對PCR產物處理，需要非常小心地防止產物污染。5.等位基因特異性擴增一個引物的3’端與特定的突變堿基相配，特異性擴增這一突變的片斷，靈敏度高，但一個反應只能檢測一個突變。比如Therascreen KRAS RGQ PCR Kit，每個樣品做8個PCR反應，也只能檢測7個常見的突變，而KRAS在密碼子12，13上可能的突變是12個。6.等位基因區別實時PCR在PCR反應中有兩個特異的探針，區別野生型和突變型，靈敏度和特異性都低于特異性擴增，也是一個反應測定一個突變。7.熒光PCR檢測點突變SYBR Green I結合熔解曲線分析點突變簡單、快速、自動化程度較高，易于推廣；但是所用的染料SYBY Green I與溴乙唆、Y0-PR0-1[—樣，缺乏序列特異性，因此不可避免的將會降低其敏感性。在擴增過程中產生的非特異性熒光，通常是由引物二聚體和其它污染物的擴增產物引起的，單以熒光很難將其與靶序列發出的熒光相區分。另外擴增產物堿基序列數較大時，單個堿基置換引起的點突變其Tm變化較小，運用SYBR Green I和熔解曲線分析就很難檢出。突光共振能量轉移(fluorescenceresonance energy transfer, FRET)結合探針熔解曲線分析點突變。通過對雜交產物穩定性進行實時監測，并結合熔解曲線分析，提高了對點突變檢測的分辨率SYBR Green I法和FRET法對點突變的檢測均依賴于熔解曲線分析，但存在著諸多限制條件，即:①熔解曲線的相對位置和寬度與所加入的染料濃度及溫度轉換率相關。在分子生物學基因點突變的研究中，仍需加強研究，克服上述各方法的不足。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種快速、簡單、成本低，無PCR產物污染的風險，適用于大批量樣品的檢測，可以精確定位突變位點，所需的DNA樣品量少的基因點突變檢測方法。為實現上述放目的，本專利技術采用如下技術方案:一種基因點突變的實時PCR檢測方法，包括以下步驟(I)實時PCR的DNA擴增循環程序；(2)解鏈曲線分析程序，(3)判定所測基因有無突變。本方法使用LightCycIer儀器和LightCycler雙雜交探針。LC儀器激發光只能激發Fluorescein,而L C突光色團只能被Fluorescein發出的光激發。本放的基因點突變的實時PCR檢測方法，所述的DNA擴增循環使用由上游探針和下游探針組成的雙探針，所述上游探針的尾端接一個Fluorescein，所述下游探針的頭端標記一 LC熒光色團，雙探針之一覆蓋突變點，突變點和雙雜交探針在引物的下游盡量靠近另一個引物。引物位于突變點兩側，LC的雙雜交探針頭尾串聯，僅相隔一，二個核苷酸。本專利技術的實時PCR檢測方法，所述的DNA擴增循環包括:1)聚合酶被激活、樣品DNA變性雙鏈分開成兩條單鏈。2)接著溫度下降至使DNA退火，3)引物聯合在樣品DNA單鏈上形成雙鏈，聚合酶以樣品DNA為模板開始合成，同時雙雜交探針也在其中一條樣品單鏈上；4)上游探針的尾端和下游探針頭端靠近，發生熒光共振能量傳遞，LC機器發光激活Fluorescein, Fluorescein發光激活LC突光色團,LC突光色團發出的光被機器紀錄。5)然后溫度升至72°C左右，在這個溫度下，雜交探針已變性離開雜交位置，聚合酶快速合成DNA形成兩條雙鏈，6)溫度又上升至90-95°C，擴增開始第二輪循環。本專利技術的實時PCR檢測方法，I)所述的聚合酶被激活是在95°C高溫10分鐘，所述DNA退火溫度，52 58°C。用于PCR檢測的樣品DNA，稀釋至5_20ng/ul。反應試劑中的多聚酶是熱啟動的DNA聚合酶，提高擴增的特異性。用解鏈曲線檢測基因突變。本專利技術的實時PCR檢測方法，(2)所述的解鏈曲線分析程序包括升高溫度變性擴增的DNA，降低溫度讓探針與單鏈DNA雜交，然后緩慢升高溫度讓探針與擴增的DNA片斷變行解鏈。本專利技術的實時PCR檢測方法，其特征在于，變性擴增的DNA溫度為95°C，退火讓探針與單鏈DNA雜交的溫度為40°C，LC熒光色團被激發發光。然后很緩慢地加熱探針擴增片斷雜交體，機器開始連續記錄熒光強度。溫度上升到一定程度使一條探針變性離開原來的位置，兩個熒光團分開，熒光共振能量傳遞消失，LC熒光色團不發光。在一個溫度點，半數雜交體上的探針離開擴增的片斷，這就是這個探針的解鏈溫度。所述讓探針與擴增的DNA片斷變性解鏈的溫度由熒光(F)和溫度(T)的負導數(-dF/dT)確定。設計時覆蓋突變點的探針是匹配野生型的。確定長度和序列的探針在確定反應條件下，解鏈溫度是一定的，波動小于rc。本專利技術的實時PCR檢測方法，(3)所述判定所測基因有無突變是根據探針解鏈的溫度來判定:如果有突變，突變點的一個或兩個堿基改變了，與探針相應堿基不匹配，探針與突變型的雜交能力下降，低于野生型的解鏈溫度就能使它變性分離。用解鏈曲線分析，突變型基因的解鏈溫度會發生左移，比野生型低3°C，雜合基因有兩個解鏈溫度峰；無突變，解鏈溫度不發生左移，有一個解鏈溫度峰。本專利技術的實時PCR檢測方法，其特征在于，擴增片斷要大于150bps，福爾馬林固定石蠟包埋的組織約200bps，血液或新鮮組織可以大至300bps。LC機器溫度變化快，達到20°C /秒，加上LC雙雜交探針，LC實時PCR特異性高。實時PCR和曲線分析反應在玻璃毛細管中進行，反應體積可少至10ul，試本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基因點突變的實時PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)實時PCR的DNA擴增循環程序；(2)解鏈曲線分析程序，(3)判定所測基因有無突變。

【技術特征摘要】
1.一種基因點突變的實時PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)實時PCR的DNA擴增循環程序；(2)解鏈曲線分析程序，(3)判定所測基因有無突變。2.根據權利要求1所述的基因點突變的實時PCR檢測方法，其特征在于，(I)所述的DNA擴增循環使用由上游探針和下游探針組成的雙探針，所述上游探針的尾端接一個Fluorescein，所述下游探針的頭端標記一 LC熒光色團，雙探針之一覆蓋突變點，突變點和雙雜交探針在弓I物的下游盡量靠近另一個弓I物。3.根據權利要求1所述的基因點突變的實時PCR檢測方法，其特征在于，⑴所述的DNA擴增循環包括:1)聚合酶被激活、樣品DNA變性雙鏈分開成兩條單鏈。2)接著溫度下降至使DNA退火，3)引物聯合在樣品DNA單鏈上形成雙鏈，聚合酶以樣品DNA為模板開始合成，同時雙雜交探針也在其中一條樣品單鏈上；4)上游探針的尾端和下游探針頭端靠近，發生熒光共振能量傳遞，5)然后溫度升至72°C左右，在這個溫度下，雜交探針已變性離開雜交位置，聚合酶快速合成DNA形成兩條雙鏈，6)溫度又上升至90-95°C，擴增開始第二輪循環。4.根據權利要 求3所述的基因點突變的實時PCR檢測方法，其特征在于，I)所述的聚合酶被激活是在95°...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周耐明，
申請(專利權)人：鎮江盛泰生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：