致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及其檢測分型方法技術

本發明專利技術適用于分子生物學及微生物檢測技術領域，提供一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒及檢測和分型方法，該檢測試劑盒包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，還包括stp、sth、lt、aggR、eaeA、escV、stx1、stx2、ipaH基因的引物及探針SEQ?ID?NO:1-SEQ?ID?NO:27，還包括序列為SEQ?ID?NO:28的Homo-tag。該檢測和分型方法包括以下步驟：獲得并處理樣品，加入至檢測試劑盒中；進行熒光定量PCR反應；獲得檢測結果。本發明專利技術的檢測和分型方法特異性好，靈敏度高，操作簡便，結果易于判讀，適用于對致瀉性大腸桿菌的快速篩查和分型。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學及微生物檢測
，尤其涉及一種。
技術介紹
大腸桿菌為人和動物腸道中的常居菌，一般多不致病，在一定條件下可引起腸道外感染。而某些血清型菌株具有較強的致病性，可引起腹瀉，此種菌株可通過飲食導致腹瀉。致瀉性大腸桿菌(DEC)是細菌性腹瀉的常見病原菌，它包括腸致病性大腸桿菌(enteropathogenie E.coli, EPEC)> 腸產毒性大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli, ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive E.coli, EIEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E.coli, EHEC)和腸粘附性大腸桿菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)。DEC感染主要見于嬰幼兒，近年來其在成人腹瀉病人中的檢出率有所增加，并成為部分地區致腹瀉的主要病原菌，且對常用藥物出現了較高的耐藥性，因此受到了廣泛的關注。傳統的分離培養技術是DEC鑒定、檢測的標準方法，但常規的細菌培養與鑒定方法不足以將各種DEC鑒別開，因為許多血清型與基因型不一致。且傳統方法需要經過一系列復雜的實驗步驟，檢測周期長，操作繁瑣，準確性低，耗時費力，無法滿足臨床和實際工作的需要。DEC引起的臨床癥狀多為水樣腹瀉，無法從癥狀判讀型別指導臨床用藥，因此這需要既能快速檢測又能實現多重檢測。隨著分子生物學技術的快速發展，PCR技術已被廣泛應用于細菌的檢測和分類。然而常規PCR技術的后電泳容易導致污染， 易產生假陽性，使檢測結果不準確。實時定量PCR以快速、準確等突出優點被廣泛應用，但目前所采用的實時定量PCR方法多為單一的熒光定量PCR方法，只能檢測一種致病菌，不能滿足多重檢測的要求，因此效率有待提高。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，旨在解決現有檢測技術中檢測對象單一，檢測效率低，準確度不高的問題。本專利技術實施例是這樣實現的，一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，包括PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，還包括以下引物和探針:針對stp基因的引物和探針:stp-F:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAAAAAGCGAGTGCACCTCGACA-3’ (SEQ ID NO:1),stp-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGTTGACTGACTAAAAGAGGGG-3’(SEQ ID NO:2)，stp-probe:5，-CGCGTCTCAAATATCCGTGAAACAACATGACGCG-3’ (SEQ ID NO:3)；針對sth基因的引物和探針:sth-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTGGTCCTGAAAGCATGAATAG-3’ (SEQ ID NO:4)，sth-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAACAAAGCAACAGGTACATACG-3，(SEQ ID NO:5),sth-probe:5’-CGCGGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGTACCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)；針對It基因的引物和探針:lt-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACAGGAGGTTTCTGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO:7)，lt-R:5’-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGTGGGAAACCTGCTAATCT-3’ (SEQ ID NO:8),lt-probe:5’-CGCCGGTATTACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCG-3’ (SEQ ID NO:9)；針對aggR基因的引物和探針:aggR-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATGCAAAAGAAGAAATCAACAGT-3， (SEQ IDNO:10),aggR-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAACAGAATCGTCAGCATCAGCTAC-3， (SEQ IDNO:11),aggR-probe:5’-CGGACAAAAGTAGATGCTTGCAGTTGTCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；針對eaeA基因的引物和探針:eaeA-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTAACCAGGCTTCGTCACA-3’ (SEQ ID NO: 13)，eaeA-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGAAAAAACGCTGACCCG-3’ (SEQ ID NO: 14)，eaeA-probe:5，-CCCAGTGGTAATAACTTTGACGGTAGTTCACTGGG-3，(SEQ ID NO: 15)；針對escV基因的引物和探針:escV-F:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG-3’ (SEQ IDNO:16)，escV-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGGAAAGAAGTTAGTTCAAGAGGAT-3’ (SEQ IDNO:17)，escV-probe:5，-CCCGCGCAACAGTTGTGGTGGATATCATTATCGCGGG-3， (SEQ ID NO:18)；針對stxl基因的引物和探針:stxl-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAASAGCGGTTACATTGTCTGGT-3，(SEQ ID NO:19)，stxl-R:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACTGCGTCAGTGAGGTTCCA-3’ (SEQ ID NO:20)，stxl-probe:5，-CCGCGTACGGGGATGCAGATAAATCGCGG-3’ (SEQ ID NO:21)；針對stx2基因的引物和探針:stx2-F: 5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAACATGACAACGGACAGCAGTTA-3，(SEQ ID NO:22)，stx2-R:5’ -GCAAGCCCTCACGTAGCGAATCTGGTCATTGTATTACCACTGAA-3’ (SEQ IDNO:23)，stx2-probe:5，-CCGCCACTCACTGGTTTCATCATATCTGGCGG-3’ (SEQ ID NO:24)；針對ipaH基因的引物和探針:ipaH-F:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGAAAACCCTCCTGGTCCATC-3’ (SEQ ID NO:25)，ipaH-R:5， -GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTT-3， (SEQ IDNO:26)，ipaH-probe:5，-CCCGGCTGGAGGACATTGCCCGGG-3’ (SEQ ID NO:27)；其中各條探針序列5’端連接有熒光基團，3’端連接有淬滅基團；該檢測試劑盒還包括如下Homo-tag:5，-GCAAGCCCTCACGTAGCGAA-3，(SEQ ID NO:28)。本專利技術實施例的另一目的在于提供一種致瀉性大腸桿菌檢測和分型方法，該檢測和分型方法利用本專利技術的致瀉性大腸桿菌檢測試劑本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，包括PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，其特征在于，還包括以下9組引物和探針：針對stp基因的引物對SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2以及探針SEQ?ID?NO:3，針對sth基因的引物對SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:5以及探針SEQ?ID?NO:6，針對lt基因的引物對SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8以及探針SEQ?ID?NO:9，針對aggR基因的引物對SEQ?ID?NO:10和SEQ?ID?NO:11以及探針SEQ?ID?NO:12，針對eaeA基因的引物對SEQ?ID?NO:13和SEQ?ID?NO:14以及探針SEQ?ID?NO:15，針對escV基因的引物對SEQ?ID?NO:16和SEQ?ID?NO:17以及探針SEQ?ID?NO:18，針對stx1基因的引物對SEQ?ID?NO:19和SEQ?ID?NO:20以及探針SEQ?ID?NO:21，針對stx2基因的引物對SEQ?ID?NO:22和SEQ?ID?NO:23以及探針SEQ?ID?NO:24，針對ipaH基因的引物對SEQ?ID?NO:25和SEQ?ID?NO:26以及探針SEQ?ID?NO:27，其中各條所述探針5’端連接有熒光基團，3’端連接有淬滅基團；該檢測試劑盒還包括序列為SEQ?ID?NO:28的Homo?tag。...

【技術特征摘要】
1.一種致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，包括PCR反應緩沖液、MgCl2、dNTP、DNA聚合酶，其特征在于，還包括以下9組引物和探針: 針對stp基因的引物對SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2以及探針SEQ ID N0:3, 針對sth基因的引物對SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5以及探針SEQ ID N0:6, 針對It基因的引物對SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8以及探針SEQ ID N0:9, 針對aggR基因的引物對SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11以及探針SEQ ID NO: 12, 針對eaeA基因的引物對SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14以及探針SEQ ID NO: 15, 針對escV基因的引物對SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17以及探針SEQ ID NO: 18, 針對stxl基因的引物對SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20以及探針SEQ ID NO:21, 針對stx2基因的引物對SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23以及探針SEQ ID NO:24, 針對ipaH基因的引物對S EQ ID NO:25和SEQ ID NO:26以及探針SEQ ID NO:27, 其中各條所述探針5’端連接有熒光基團，3’端連接有淬滅基團； 該檢測試劑盒還包括序列為SEQ ID NO:28的Homo-tag。2.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述9組引物和探針分裝至兩個反應管體系中，使 SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 12 與 SEQ ID N0:13_SEQ ID NO: 27分隔開。3.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為rTaq 酶。4.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述MgCl2的工作濃度為2-4mmol，所述dNTP的工作濃度為0.1-0.3mmol，所述DNA聚合酶工作濃度為0.8-1.2U。5.如權利要求1所述的致瀉性大腸桿菌檢測試劑盒，其特征在于，所述引物序列SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4, SEQ ID...

【專利技術屬性】
技術研發人員：扈慶華，石曉路，李迎慧，林一曼，邱亞群，陳瓊城，陳清涼，姜伊祥，
申請(專利權)人：深圳市疾病預防控制中心，
類型：發明
國別省市：