本發明專利技術一種檢測人HLA-B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒，包括含有檢測HLA-B*57:01和HCP5引物的PCR反應液，檢測HLA-B*57:01的引物為引物B57F、B57R1、B57R2，引物B57F的序列如SEQIDNO：1所示，引物B57R1的序列如SEQIDNO：2所示、引物B57R2的序列如SEQIDNO：3所示，檢測HCP5的引物為引物631R和568GF，引物631R的序列如SEQIDNO：4所示、引物568GF的序列如SEQIDNO：5所示。本發明專利技術的試劑盒檢測靈敏度高，特異性好，無需測序就可精確地對其基因型進行分型。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，涉及一種基因分型檢測試劑盒，特別是一種檢測人HLA-B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒。
技術介紹
人白細胞抗原(HLA)是細胞表面分子，是調控人體特異性免疫應答的主要基因系統，HLA基因位于第6號染色體短臂，由眾多復雜的等位基因構成，是目前所知多態性最復雜的遺傳系統。由HLA多態性的基因編碼的HLA蛋白對免疫介導或控制的疾病的易感性、個體變異、及藥物誘發的副反應中起重要作用。以前往往通過血清學檢測進行HLA分型，但結果并不精確。現在一般則是通過HLA的序列來分析HLA的基因型。盡管測序的方法能得到最準確的序列信息，但是這會花費大量的時間，在臨床中并不適用。近年的研究表明，HLA-B的基因的多態與藥物的不良反應密切相關。一些研究人員發現，在對HIV攜帶者進行治療時，一些患者對抗艾滋藥物阿巴卡韋(Abacavir，簡稱ABC)會產生嚴重的全身過敏性反應，甚至危及生命。進一步研究發現，HLA-B*57:01與ABC產生的嚴重的全身過敏反應存在密切關系，是目前發現的與藥物反應的相關性最好的遺傳標記物之一，此耐藥項目的研究人員Simon Mallal于2003申請的專利W003/068958A1中公開了使ABC產生藥物反應的基因座位置和檢測方法。因此，為此艾滋病治療指南要求患者在使用ABC藥物前，必須篩查HLA-B*57:01基因，當檢測結果為陰性，即患者不含HLA-B*57:01基因時方可使用ABC藥物。HCP5是與HLA_B*57:01基因緊密連鎖不平衡的位點rs2395029，表現為單核苷酸多態性(SNP) 568G核苷酸，檢測HCP5位點單核苷酸多態性可作為鑒定HLA-B*57:01基因的一種替代標記，HLA_B*57:01與HCP5的聯合檢測能顯著增加HLA-B*57:01基因鑒定的可靠性。 雖然以前的研究證實了 HLA_B*57:01基因與抗艾滋藥物阿巴卡韋的過敏反應存在相關性，艾滋病治療指南也要求患者在使用ABC藥物前必須篩查HLA-B*57:01基因，但目前缺乏對HLA-B*57:01基因檢測的試劑盒。同時，現在的測序方法雖然能得到精確的序列信息，但并不適合在檢測時大規模推廣。因此，獲得HLA檢測結果所需的高額費用和相對長的檢測時間就成為有效實施治療指南的主要障礙。對于能以低費用進行的簡單、精確且快速的HLA_B*57:01檢測存在巨大的需求。使用PCR序列特異性引物(sequence specificprimer, SSP)分析技術檢測，這種方法是使用能夠特異識別特定等位基因的引物，以PCR擴增后檢測序列多態性。根據決定某等位基因的堿基性質，設計3,端第一個堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR反應過程中，只有引物3'端第一個堿基與決定特定等位基因的堿基互補時才能實現DNA片段的完全復制，根據PCR產物的有無進行等位基因的分型。這種方法可使我們目前開展的檢測手段的標準化，無需測序，通過序列條帶就能分辨特異性的HLA基因。但是，雖然PCR-SSP只需要PCR就可以確定基因型的SNP，簡便、廉價，適合于分子標記的要求。但是該技術沒有被大量用于檢測基因型的SNP，其主要原因是引物的穩定性較差。國內現在尚無HLA-B*57:01基因檢測試劑盒，國際上雖然有對HLA_B*57:01基因檢測的試劑盒，但是采用通用引物擴增后測序的方法進行HLA-B*57:01基因的檢測，導致了樣品檢測時間較長，檢測成本較高。專利技術概述本專利技術所要解決的技術問題是提供一種檢測人HLA_B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒，所述的這種檢測人HLA-B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒解決了現有技術中的試劑盒檢測HLA-B*57:01基因的時間長，檢測成本高的技術問題。本專利技術提供了一種檢測人HLA_B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒，包括含有檢測HLA-B*57:01和HCP5引物的PCR反應液，所述的檢測HLA_B*57:01的引物為引物B57F、引物B57R1、引物B57R2，所述的引物B57F的序列如SEQ ID NO:1所示，所述的引物B57R1的序列如SEQ ID NO:2所示，所述的引物B57R2的序列如SEQ ID NO:3所示，所述的檢測HCP5的引物為引物631R和引物568GF，所述的引物631R的序列如SEQ ID NO:4所示、所述的引物568GF的序列如SEQ ID NO:5所示，所述的引物B57F、引物B57R1、引物B57R2、引物631R和引物568GF在PCR反應液中的濃度分別為0.5 μ M。進一步的，在所述的PCR反應液中還含有內對照引物，所述的內對照引物為引物HGHF和引物HGHR24，所述的引物HGHF的序列如SEQ ID NO:6所示、所述的引物HGHR24的序列如SEQ ID NO:7所示，所述的內對照引物HGHF和HGHR24在PCR反應液中的濃度分別為 0.2 μ Μ。進一步的，在所述的PCR反應液中還包括染料，dNTPs和PCR緩沖體系。 優選的，所述的染料為甲酚紅，濃度為0.01%(wt/vol) ；dNTPs的濃度為0.2mM。優選的，所述的PCR緩沖體系為由Tris-HCl、氯化鉀、氯化鎂和明膠組成，在所述的緩沖體系中，所述的Tris-HCl的濃度為10mM，所述的氯化鉀的濃度為50mM，所述的氯化鎂的濃度為1.5mM，所述的明膠的濃度為0.001%(wt/vol)。進一步的，本專利技術試劑盒中還包括Taq酶，所述的Taq酶的最終使用量為0.3單位/微升。本專利技術還提供了用于上述的試劑盒的檢測人HLA_B*57:01等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO:1所示。本專利技術還提供了用于上述的試劑盒的檢測人HLA_B*57:01等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO:2所示。本專利技術還提供了用于上述的試劑盒的檢測人HLA_B*57:01等位基因的引物，其序列如SEQ ID NO:3所示。本專利技術還提供了用于上述的試劑盒的檢測人HCP5等位基因的引物，其序列如SEQID NO:4 所示。本專利技術還提供了用于上述的試劑盒的檢測人HCP5等位基因的引物，其序列如SEQID NO:5 所示。具體的，引物B57F (SEQ ID N0:1)，B57R1 (SEQ ID N0:2)，B57R2 (SEQ ID NO: 3)用于檢測HLA-B*57:01等位基因，兩條反向引物B57R1 (SEQ ID N0:2)和B57R2 (SEQ IDN0:3)能完全涵蓋目標的SNP位點，杜絕了對此基因漏檢的可能，并在引物的3’端引入了錯配堿基以增加引物的特異性。引物631R (SEQ ID NO:4)和引物568GF (SEQ ID N0:5)用于檢測HCP5基因，位于染色體rs2395029SNP568G核苷酸和HLA_B*57:01等位基因緊密連鎖。在此SNP位點附近設計上下游引物，其中下游引物3’端涵蓋此SNP位點，通過檢測rs2395029SNP位點，能保證本試劑盒檢測結果的準確性。引物HGHF(SEQ ID N0:6)和HGHR(SEQ ID N0:7)是內對照引物，擴增人類生長因子基因片段，擴增片段長度42本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測人HLA?B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒，其特征在于：包括含有檢測HLA?B*57:01和HCP5引物的PCR反應液，所述的檢測HLA?B*57:01的引物為引物B57F、引物B57R1、?引物B57R2，所述的引物B57F的序列如?SEQ?ID?NO?：1所示，所述的引物B57R1的序列如?SEQ?ID?NO?：2所示，所述的引物B57R2的序列如?SEQ?ID?NO?：3所示，所述的檢測HCP5的引物為引物631R和引物568GF，所述的引物631R的序列如?SEQ?ID?NO?：4所示、所述的引物568GF的序列如?SEQ?ID?NO?：5所示,?所述的引物B57F、引物B57R1、引物B57R2、引物631R和引物568GF在PCR反應液中的濃度分別為0.5μM。
【技術特征摘要】
1.一種檢測人HLA-B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒，其特征在于:包括含有檢測HLA-B*57:01和HCP5引物的PCR反應液，所述的檢測HLA_B*57:01的引物為引物B57F、引物B57R1、引物B57R2，所述的引物B57F的序列如SEQ ID NO:1所示，所述的引物B57R1的序列如SEQ ID NO:2所示，所述的引物B57R2的序列如SEQ ID NO:3所示，所述的檢測HCP5的引物為引物631R和引物568GF，所述的引物631R的序列如SEQ ID NO:4所示、所述的引物568GF的序列如SEQ ID NO:5所示，所述的引物B57F、引物B57R1、引物B57R2、引物631R和引物568GF在PCR反應液中的濃度分別為0.5μΜ。2.如權利要求1所述的一種檢測人HLA-B*57:01和HCP5等位基因的試劑盒，其特征在于:在所述的PCR反應液中還含有內對照引物，所述的內對照引物為引物HGHF和引物HGHR24，所述的引物HGHF的序列如SEQ ID NO:6所示、所述的引物HGHR24的序列如SEQID NO:7所示，所述的內對照引物HGHF和HGHR24在PCR反應液中的濃度分別為0.2μΜ。3.如權利要求1所述的一種檢測人HLA-B*57:Ol和HCP5等位基因的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的PCR反應液中還包括染料，dNTPs和PCR緩沖體系。4.如權利要求3所述的一種檢...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙桐茂，詹申宏，羅振武，
申請(專利權)人：上海血液生物醫藥有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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