一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法技術

本發明專利技術提供了一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法，包括單核苷酸多態性位點的篩選、血漿中位點DNA的提取、PCR擴增反應、胎兒DNA量的計算等步驟。該方法操作方法簡單，采用基于單核苷酸多態性位點的擴增，避免了使用Y染色體遺傳位點標記難以測定孕女胎的孕婦血漿中胎兒游離DNA的含量，應用廣泛、準確度高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，涉及一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法，還涉及該測定方法的應用，如產前檢測。
技術介紹
當前，產前檢測越來越受到人們的關注，產前檢測是減少出生缺陷兒的有效措施之一。但是傳統的侵入性診斷技術對母親和胎兒都會造成一定的風險，因而在臨床上限制了其運用。近年來，無創傷性產前診斷受到越來越多的關注，而孕婦血漿中胎兒游離DNA的發現無疑為無創傷性產前診斷開辟了新的途徑。因此，圍繞孕婦血漿游離DNA的研究越來越多，也發展出了許多潛在的臨床應用。比如，母體血漿中胎兒DNA含量的異常與許多妊娠相關的疾病有關，包括先兆子癇、早產、產前出血、侵入性胎盤形成、胎兒唐氏綜合癥和其他胎兒染色體非整倍性。因此，母親血漿的胎兒DNA分析可以作為監測胎兒健康的潛在標志物之一。然而，由于母親血漿中胎兒游離DNA的含量只占總數的5%_30%，是處于一種高母體DNA的背景下，使得我們在進行無創產前診斷的過程中常常會因為胎兒游離DNA的含量過低而呈現假陰性的結果。為了同母親來源的游離DNA區分，目前選取胎兒游離DNA標記物主要來自Y染色體遺傳位點，這使得胎兒游離DNA含量的檢測局限在懷男性胎兒的孕婦當中。因此，開發一種能夠廣泛應用的檢測孕婦血漿中胎兒DNA含量的新技術，是一項意義深遠的工作。
技術實現思路
專利技術目的:本專利技術的目的是提供一種操作簡單、準確度高、應用廣泛的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法。技術方案:本專利技術提供的一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法，包括以下步驟:步驟一，單核苷酸多態性位點的篩選:從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態性位點庫(dbSNP)中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態性位點:(I)小等位基因頻率(MAF)在0.4-0.5之間；(2)包含該多態性位點的DNA片段長度為50_70bp ；(3)位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態性位點；(4)包含該多態性位點的DNA片段不是位于基因組變異數據庫中拷貝數變異范圍之內；(5)該多態性位點所處的片段 在人類基因組范圍內是特異的，保證該片段在人類基因組上是唯一的；(6)包含該多態性位點的DNA片段之間是相互兼容的，即該多態性位點的DNA片段之間，沒有超過8bp的互補序列，同時各個多態性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。步驟一中，單核苷酸多態性位點的篩選可利用軟件完成，包括以下步驟:(以下步驟根據附附圖說明圖1得到，然而，該步驟及附圖1并未顯示篩選出該多態性位點的DNA片段長度為50-70bp ;此外，附圖1上兩端50_60bp不包含SNP位點請根據之前修改的權I修改)(1)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態性位點庫(dbSNP)中依據小等位基因頻率數值過濾，提取出小等位基因頻率在0.4-0.5之間的單核苷酸多態性位點，提取出的片段長度為50-70bp ；(2)將步驟(I)得到的單核苷酸多態性位點與人類基因組比較，提取出在人類基因組上是唯一的單核苷酸多態性位點；(3)過濾步驟(2)得到的單核苷酸多態性位點，提取出位點上下游距離位點l-60bp之間不包含任何單核苷酸多態性位點的單核苷酸多態性位點；(4)將步驟(3)得到的單核苷酸多態性位點與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因組變異數據庫(DGV)中拷貝數變異(CNV)信息進行比較，過濾掉包含拷貝數變異(CNV)信息的單核苷酸多態性位點；(5)將步驟(4)得到的單核苷酸多態性位點與BWA索引數據庫比較，并過濾，使剩余的單核苷酸多態性位點的DNA片段之間是相互兼容的，即該多態性位點的DNA片段之間，沒有超過8bp的互補序列，同時各個多態性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。步驟二，血漿中位點DNA的提取:提取待測血漿中游離DNA，并分離出包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段:首先根據篩選出的位點設計探針；將探針綁定到生物磁珠上；將樣品DNA加入到帶有探針的生物磁珠中，使DNA與探針雜交；洗去多余的DNA模板；將綁定的樣品DNA從生物磁珠上洗脫下來。步驟三，PCR擴增反應:對步驟一中獲得的單核苷酸多態性位點序列設計PCR引物，并利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增步驟二分離的游離DNA片段，得PCR擴增產物；步驟四，胎兒DNA量的計算:對步驟三獲得PCR擴增產物測序，并統計分析每個位點的測序片段量，根據不同等位基因之間的比率，計算胎兒DNA的量。其中，步驟二中，所述待測血漿由以下方法獲得:抽取5-10ml孕婦外周血，離心分離獲得血漿。其中，步驟二中，包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段的分離方法，包括以下步驟:( 1)根據步驟一獲得的位點序列設計探針；(2)將探針綁定到生物磁珠上；(3)將提取的待測血漿中游離DNA加入到帶有探針的生物磁珠中，使DNA與探針雜交；(4)用商品化磁珠試劑盒中的清洗液洗去多余的DNA ；(5)用商品化磁珠試劑盒中的洗脫液將綁定的樣品DNA從生物磁珠上洗脫下來。有益效果:本專利技術提供的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法，操作方法簡單，采用基于單核苷酸多態性位點的擴增，避免了使用Y染色體遺傳位點標記難以測定孕女胎的孕婦血漿中胎兒游離DNA的含量，應用廣泛、準確度高。該方法通過篩選獲得特定單核苷酸多態性位點，能夠準確測定胎兒DNA的含量，避免母親來源的游離DNA影響出現假陰性的結果，準確性高。同時，本專利技術可采用第二代高通量測序平臺，準確度高、數據量大、極大的降低了成本。說明書附1為本專利技術單核苷酸多態性位點的篩選方法的流程圖。圖2為本專利技術孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法的流程圖。圖3為本專利技術孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定結果。具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術。本專利技術所使用的試劑及軟件分別為:試劑:QiAamp Blood Mini Kit (Qiagen)提取 DNA 試劑盒Taq DNA聚合酶 購自MBI公司dNTPs 購自 Τ0Υ0Β0 公司探針、引物由上海生物工程公司合成TruSeq DNA HT Sample Prep Kit Support (iIlumina)測序試劑盒ddH20普通重蒸水(自制)dNTP Τ0Υ0Β0 公司Buffer Takara 公司20 μ M正向引物上海生物工程公司20 μ M反向引物上海生物工程公司DNA聚合酶MBI公司IOngDNA提取的孕婦外周血血漿DNA軟件:自編peri 腳本，BWA實施例1基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法，包括以下步驟:步驟一，單核苷酸多態性位點的篩選:從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態性位點庫(dbSNP)中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態性位點:(I)小等位基因頻率(MAF)在0.4-0.5之間；(2)包含該多態性位點的DNA片段長度為50_70bp ；(3)位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態性位點；(4)包含該位點的50_70bp本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA含量的測定方法，其特征在于：包括以下步驟：?步驟一，單核苷酸多態性位點的篩選：從單核苷酸多態性位點庫中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態性位點：?（1）小等位基因頻率在0.4?0.5之間；?（2）包含該多態性位點的DNA片段長度為50?70bp；?（3）位點上下游距離位點1?60bp之間不包含任何單核苷酸多態性位點；?（4）包含該多態性位點的DNA片段不是位于基因組變異數據庫中拷貝數變異范圍之內；?（5）該多態性位點所處的片段在人類基因組范圍內是特異的；?（6）包含該多態性位點的DNA片段之間是相互兼容的，即該多態性位點的DNA片段之間，沒有超過8bp的互補序列，同時各個多態性位點的DNA片段的GC含量應該在45?55%之間。?步驟二，血漿中包含位點序列游離DNA片段的提取：提取待測血漿中游離DNA，并分離出包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段；?步驟三，PCR擴增反應：對步驟一中獲得的單核苷酸多態性位點序列設計PCR引物，并利用聚合酶鏈反應擴增步驟二分離的游離DNA片段，得PCR擴增產物；?步驟四，胎兒DNA量的計算：對步驟三獲得PCR擴增產物測序，并統計分析每個位點的片段數量，根據不同等位基因之間的比率，計算胎兒DNA的量。...

【技術特征摘要】
1.一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNAi量的測定方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一，單核苷酸多態性位點的篩選:從單核苷酸多態性位點庫中初步篩選出滿足以下條件的單核苷酸多態性位點: Cl)小等位基因頻率在0.4-0.5之間； (2)包含該多態性位點的DNA片段長度為50-70bp； (3)位點上下游距離位點l_60bp之間不包含任何單核苷酸多態性位點； (4)包含該多態性位點的DNA片段不是位于基因組變異數據庫中拷貝數變異范圍之內； (5)該多態性位點所處的片段在人類基因組范圍內是特異的； (6)包含該多態性位點的DNA片段之間是相互兼容的，即該多態性位點的DNA片段之間，沒有超過8bp的互補序列，同時各個多態性位點的DNA片段的GC含量應該在45-55%之間。步驟二，血漿中包含位點序列游離DNA片段的提取:提取待測血漿中游離DNA，并分離出包括步驟一獲得的位點序列的游離DNA片段； 步驟三，PCR擴增反應:對步驟一中獲得的單核苷酸多態性位點序列設計PCR引物，并利用聚合酶鏈反應擴增步驟二分離的游離DNA片段，得PCR擴增產物； 步驟四，胎兒DNA量的 計算:對步驟三獲得PCR擴增產物測序，并統計分析每個位點的片段數量，根據不同等位基因之間的比率，計算胎兒DNA的量。2.根據權利要求1所述的一種基于單核苷酸多態性位點的孕婦血漿中胎兒DNA立量的測定方法，其特征在于:步驟一中，單核苷酸多態性位點的篩選可利用軟件完成，包括以下步驟: (1)從美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態性位點庫(dbSNP)中依據小等位基因頻率數值過濾，提取出小...

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁波，孔令印，
申請(專利權)人：賽業蘇州生物信息技術有限公司，
類型：發明
國別省市：