一種染色體特異位點的篩選方法及應用技術

本發明專利技術提供了一種染色體特異位點的篩選方法，包括染色體特異位點的初步篩選、染色體特異位點的比較去除、利用PCR引物設計方法對染色體特異位點的篩選、利用實時定量PCR反應對PCR引物篩選位點的精篩等步驟。本發明專利技術還提供了該篩選方法在產前檢測中的應用。本發明專利技術提供的染色體特異位點的篩選方法利用常用計算機軟件在特定的一條染色體上篩選出特異位點序列，操作簡單、成本低廉、篩選得到的特異位點序列數量少、特異性高。

【技術實現步驟摘要】
一種染色體特異位點的篩選方法及應用
本專利技術屬于生物
，涉及一種染色體特異位點的篩選方法，還涉及該篩選方法的應用，如產前檢測。
技術介紹
我國是人口大國，也是出生缺陷高發國家。根據衛生部最新發布的《中國出生缺陷防治報告(2012)》顯示，出生缺陷日益成為我國突出的公共衛生問題和社會問題。目前我國每年出生新生兒約為1600萬，出生缺陷發生率在5.6%左右，即每年新增出生缺陷約90萬例。造成大量先天缺陷的主要原因是染色體異常，其中染色體異常主要是指染色體的數目或者結構發生異常。數量異常指體細胞組織中正常二倍體46條染色體數目的改變，包括三體(一條額外的染色體)、單體(一條染色體缺失)和多倍體(整套額外的染色體)。結構異常指由染色體斷裂及隨后斷裂的染色體末端在異常的位置愈合導致結構重拍，包括易位、倒位和插入等。染色體非整倍性是導致胎兒先天缺陷的重要原因之一，其引起最為常見的疾病包括唐氏綜合征(T21)、愛德華氏綜合征(T18)、帕陶氏綜合征(T13)等，這三種染色體非整倍性異常占染色體非整倍體畸變95%以上，占全部染色體異常的80% 90%。由于目前沒有治療染色體疾病的有效手段，降低生育染色體疾病患兒風險的最好方法就是通過產前遺傳咨詢及產前檢測、診斷，盡早發現并解決問題。對于一些染色體遺傳疾病的產前檢測手段主要是血清學篩查(唐氏篩查)、頸項透明帶(NT)檢測、絨毛取樣、羊水穿刺以及臍靜脈血穿刺等，其中血清學篩查(唐氏篩查)和頸項透明帶(NT)檢測假陽性率比較高為5%，同時漏診率也比較高為20%-40%。雖然絨毛取樣、羊水穿刺以及臍靜脈血穿刺準確率較高，但是具有一定的流產風險，同時能夠進行穿刺的醫生也比較少，資源比較緊缺。新的檢測方法在不斷的研究之中。1997年,Lo等人(Lo Y.M.et al.1997.Lancet)在孕婦的外周血漿中發現了胎兒的游 離DNA，使得科學家在理論上可以通過母親血液檢測胎兒DNA，從而檢測胎兒的出生缺陷。然而血液中的游離胎兒DNA片段短，一般為166bp左右，而且含量較少，一般能夠占總的游離DNA5%-30%，因而給全面的檢測這些胎兒DNA帶來了困難。近年來，隨著高通量測序技術的發展，科學家可以通過測序技術來分析母體外周血中的胎兒游離DNA，這時候，無創DNA產前檢測技術便從理論變成了現實。隨后大量的臨床試驗驗證了此技術，準確率高達99%以上，具有安全，無侵入性，準確率高，孕早期即可檢測等特點。然而，此技術還有一定的不足，由于此技術需要對整個基因組DNA片段都進行檢測，人類整個基因組的基因序列就有30多億個堿基，對所有的這些堿基進行測序，需要測序量比較大，導致產前檢測的價格比較高，不利于大規模的推廣，如目前利用Illumina公司的Hiseq2000測序儀進行無創DNA產前檢測，一個泳道最多能夠完成12個樣品，一個樣品的檢測價格5000多元。
技術實現思路
專利技術目的:本專利技術的目的是提供一種操作簡單、成本低廉、測定準確的染色體特異位點的篩選方法。本專利技術的第二目的是提供上述篩選方法在產前檢測中的應用。技術方案:本專利技術提供的一種染色體特異位點的篩選方法，其特征在于:包括以下步驟:步驟一，染色體特異位點的初步篩選:根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)的人類基因組序列(GRCH Build37)，對待研究的一條染色體特異位點初步篩選，得20-30萬個初篩位點序列，所述初篩位點序列滿足以下條件:(I)序列長度的取值范圍50-70bp ；(2) GC含量在45% 55%之間；(3)序列中不包含字符“N”；(4)與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的單核苷酸多態性位點庫(dbSNP)進行比較，序列中不存在任何單核苷酸多態性位點(SNP)；(5)與美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因組變異數據庫(DGV)中拷貝數變異(CNV)信息進行比較，位點不能包含在任何已知的拷貝數變異(CNV)中；(6)位點之間在Tm值以及互補方面具有較大的兼容性；即兩位點片段間不能有超過IObp的同源序列，片段間的Tm值相差在4度以內。步驟二,染色體特異位點的比較去除:利用一些開源的工具(如:BWA、Bowtie等)將步驟一得到的初篩位點序列與人類基因組序列(GRCH Build37)比較分析，去除在多個地方匹配的位點，僅保留在一個位點匹配的序列，得5-10萬個單一匹配位點序列；步驟三，利用PCR引物設計方法對染色體特異位點的篩選:利用引物設計方法(如:Primer3、Primer Premier5.0、01igo等)對步驟二中獲得的單一匹配位點序列設計PCR引物，并去除不符合以下條件的單一匹配位點序列，得5000-1萬個PCR引物篩選位點序列:單一匹配位點序列的PCR引物不能互補，且所有PCR引物Tm值基本一致，Tm值相差不超過4 ；步驟四，利用實時定量PCR對PCR引物篩選位點的精篩:對步驟三中獲得的PCR弓丨物篩選位點序列混合并利用實時定量PCR反應檢測驗證，去除不符合以下條件的PCR引物篩選位點序列，得2000-3000 個染色體特異位點:PCR引物篩選位點的擴增效率基本一致，即通過實時定量PCR繪制出的標準曲線斜率相差不超過0.2。步驟一中，初步篩選可利用軟件完成，包括以下步驟:(I)從人類基因組序列提取位點序列，篩選出不包含字符“N”以及GC含量在45% 55%的位點；(2)將步驟(I)得到的位點與單核苷酸多態性位點庫以及基因組變異數據庫中拷貝數變異信息進行比較，篩選出不存在任何單核苷酸多態性位點和拷貝數變異信息的位占.(3)將步驟(2)得到的位點與BWA索引數據庫比較，并過濾，使位點片段之間在Tm值以及互補方面具有較大的兼容性，即兩位點片段間不能有超過IObp的同源序列，片段間的Tm值相差在4度以內。本專利技術還給出了上述染色體特異位點的篩選方法在產前檢測中的應用，即將步驟四獲得的2000-3000個染色體特異位點中隨機選擇500-1000個特異位點對待測染色體進行檢測。有益效果:本專利技術提供的染色體特異位點的篩選方法利用常用計算機軟件在特定的一條染色體上篩選出特異位點序列，操作簡單、成本低廉、篩選得到的特異位點序列數量少、特異性高。本專利技術提供的染色體特異位點的篩選方法在特定染色體上篩選出的特異位點序列可用于無創DNA產前檢測，分析孕婦的胎兒患有染色體疾病的可能性。由于可測定特定染色體上的特異位點，克服了現有檢測技術針對整個基因組的所有染色體進行高通量測序需要測量大量無關數據的缺陷，可顯著的提高無創DNA檢測的通量，從而可以降低產前檢測的成本。如目前利用Illumina公司的HiSeq2000測序儀,一個泳道最多能夠分析12個樣品，而利用本專利技術以后一個泳道可以運行80-100個樣品，顯著的提高了檢測的通量，降低了無創DNA產前檢測成本，從而更加有利于無創DNA產前檢測的大規模推廣。附圖說明圖1為本專利技術染色體特異位點的篩選方法流程圖。圖2為本專利技術染色體特異位點的篩選方法在產前檢測中應用的流程圖。具體實施方式根據下述實施例 ，可以更好地理解本專利技術。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本專利技術，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本專利技術本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種染色體特異位點的篩選方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟一，染色體特異位點的初步篩選：根據已經人類基因組序列，對待研究的一條染色體特異位點初步篩選，得20?30萬個初篩位點序列，所述初篩位點序列滿足以下條件：（1）序列長度的取值范圍50?70bp；（2）GC含量在45%～55%之間；（3）序列中不包含字符“N”；（4）與單核苷酸多態性位點庫進行比較，序列中不存在任何單核苷酸多態性位點；（5）與基因組變異數據庫中拷貝數變異信息進行比較，位點不能包含在任何已知的拷貝數變異中；（6）位點片段之間在Tm值以及互補方面具有較大的兼容性，即兩位點片段間不能有超過10bp的同源序列，片段間的Tm值相差在4度以內。步驟二，染色體特異位點的比較去除：將步驟一得到的初篩位點序列與人類基因組序列比較分析，去除在多個地方匹配的位點，僅保留在一個位點匹配的序列，得5?10萬個單一匹配位點序列；步驟三，利用PCR引物設計方法對染色體特異位點的篩選：對步驟二中獲得的單一匹配位點序列設計PCR引物，并去除不符合以下條件的單一匹配位點序列，得5000?1萬個PCR引物篩選位點序列：單一匹配位點序列的PCR引物不能互補，且所有PCR引物Tm值基本一致，即Tm值相差不超過4；步驟四，利用實時定量PCR對步驟三中篩選出的位點進行精篩：對步驟三中獲得的PCR引物篩選位點序列混合并利用實時定量PCR反應檢測驗證，去除不符合條件的PCR引物篩選位點序列，得2000?3000個染色體特異位點：PCR引物篩選位點的擴增效率基本一致，即通過實時定量PCR繪制出的標準曲線斜率相差不超過0.2。...

【技術特征摘要】
1.一種染色體特異位點的篩選方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一，染色體特異位點的初步篩選:根據已經人類基因組序列，對待研究的一條染色體特異位點初步篩選，得20-30萬個初篩位點序列,所述初篩位點序列滿足以下條件: (1)序列長度的取值范圍50-70bp； (2)GC含量在45% 55%之間； (3)序列中不包含字符“N”； (4)與單核 苷酸多態性位點庫進行比較，序列中不存在任何單核苷酸多態性位點； (5)與基因組變異數據庫中拷貝數變異信息進行比較，位點不能包含在任何已知的拷貝數變異中； (6)位點片段之間在Tm值以及互補方面具有較大的兼容性，即兩位點片段間不能有超過IObp的同源序列，片段間的Tm值相差在4度以內。步驟二，染色體特異位點的比較去除:將步驟一得到的初篩位點序列與人類基因組序列比較分析，去除在多個地方匹配的位點，僅保留在一個位點匹配的序列，得5-10萬個單一匹配位點序列； 步驟三，利用PCR引物設計方法對染色體特異位點的篩選:對步驟二中獲得的單一匹配位點序列設計PCR引物，并去除不符合以下條件的單一匹配位點序列，得5000-1萬個PCR引物篩選位點序列:單一匹配位點序列的PCR引物不能互補，且所有PCR引物Tm值基本一致，即...

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁波，孔令印，
申請(專利權)人：賽業蘇州生物信息技術有限公司，
類型：發明
國別省市：