本發明專利技術公開了一種基于Taqman探針的麥氏弧菌（Vibriometschnikovii）的熒光定量PCR快速檢測方法，采用麥氏弧菌特異性引物和TaqMan探針，即可對水產品中麥氏弧菌進行檢測與監控?。其中上游引物Vmetschnikovii-1：5'-GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC-3'，下游引物Vmetschnikovii-2：5'-CCAAGATGGTCGATATCATC-3'，特異性TaqMan探針為：Vmetschnikovii-3：5'-CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3'。檢測麥氏弧菌的方法包括細菌基因組DNA的提取、麥氏弧菌的熒光定量PCR檢測。其優點是快速、特異性強、靈敏度高。另外，本發明專利技術與普通PCR技術相比，不需要凝膠電泳拍照觀察，實現了檢測流程一體化封閉檢測，避免了PCR產物對實驗室的污染。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種基于Taqman探針的水產品中麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii)的熒光定量PCR快速檢測方法。
技術介紹
麥氏弧菌(Kibrio me tschniko rii )是革蘭氏陰性菌，短小稍彎曲的弧狀菌,無芽孢、無莢膜，有偏端單鞭毛一根，運動方式呈直線穿梭樣，嗜鹽菌，TCBS (Thiosulfatecitrate bile salts sucrose agar culture medium)平板上生長，菌落呈黃色。麥氏弧菌是一種致病性弧菌，廣泛存在于河流、海灣和下水道中。麥氏弧菌被國內外學者公認為11種致病性弧菌之一，能夠引起腹瀉、創傷性感染和敗血癥。在飲用水中與腹瀉病之間存在著密切的聯系。現有麥氏弧菌的檢測方法主要有傳統常規分離鑒定法、普通PCR檢測法、ATB細菌鑒定法等。基于Taqman探針的熒光定量PCR技術通過TaqMan探針與模板的特異性雜交來鑒別模板，具有很高的準確性，假陽性低，特異性好。目前尚未見用TaqMan探針快速檢測水產品中麥氏弧菌的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種檢測速度快、靈敏度高的快速檢測水產品中麥氏弧菌的基于Taqman探針的熒光定量PCR方法。 研究表明:麥氏弧菌攜帶的rpoB基因是RNA聚合酶β亞單位編碼基因，具有較高的保守性。本專利技術根據NCBI (美國國立生物技術信息中心)網站上公布的麥氏弧菌rpoB基因全序列，以該特異基因的保守序列設計特異性引物和TaqMan探針，并且采用熒光定量PCR快速技術檢測麥氏弧菌，具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。可以作為水產品中麥氏弧菌的快速、簡便、準確的檢測方法。本專利技術的技術解決方案是:一種快速檢測麥氏弧菌的方法，其特征在于有如下步驟: Cl)首先提取待檢樣品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA。(2)熒光定量PCR反應液(25μ 體系):其中包括提取的基因組 DNA，2PL ； 10 XPCR buffer, 2.5μ ；Mg2+, 2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG酶IU ;dNTP 0.2mmol/L ;麥氏弧菌特異性引物IOpmol ;TaqMan探針5pmol,最后加滅菌去離子水至25μ 。(3)熒光定量PCR儀程序參數:94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，同時收集FAM熒光，72°C延伸30s，40個循環。其中麥氏弧菌特異性引物為:上游引物 Vmetschnikovi1-1:5’- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3’ 下游引物 Vmetschnikovi1-2:5’- CCAAGATGGTCGATATCATC -3’ 特異性TaqMan探針為:Vmetschnikovi1-3:5’- CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3’ 熒光定量PCR反應結束后，麥氏弧菌能形成典型的S型擴增曲線，而且Ct值〈35。方法建立后利用麥氏弧菌標準菌株和其他弧菌進行了特異性和敏感性實驗。I熒光定量PCR特異性 利用建立的熒光定量PCR方法檢測麥氏弧菌標準菌株ATCC 700040，結果顯示麥氏弧菌用熒光定量PCR檢測為陽性擴增，生成S形的熒光曲線，對溶藻弧菌ATCC 17749、最小弧菌CGMCC(B) 1.1969、副溶血弧菌ATCC 17802、創傷弧菌CCGMC 1.1758、哈維氏弧菌CGMCC(B) 1.1593和弗尼斯弧菌CGMCC(B) 1.1613的檢測結果均為陰性，結果見附圖1。2熒光定量PCR敏感性 麥氏弧菌標準菌株ATCC 700040在營養肉湯中36±1°C培養24小時后，10倍梯度稀釋后，熒光定量PCR檢測結果顯示，25μ 反應體系中，最低檢測下線為102 CFU/25PL，此時熒光定量PCR擴增可以生成S形 的熒光曲線，結果見附圖2。本專利技術提供了擴增麥氏弧菌的特異性引物Vmetschnikovi1-l、Vmetschnikovi1-2和TaqMan探針Vmetschnikovii_3,從而提供了一種快速檢測麥氏弧菌的方法，同現有檢測技術相比具有如下優勢: 快速性:沒有后處理，不用電泳、拍照，實時縮短了反應時間。靈敏度高:光譜技術和計算機技術的聯合使用，極大提高了檢測的靈敏度。特異性強:熒光信號的產生不僅強烈依賴于靶模板同探針的雜交，而且同時強烈依賴于靶模板的擴增，二者缺一不可，故不存在非特異性擴增現象。有效解決PCR污染:整個過程均在單管中進行，且勿需打開管蓋，避免了 PCR產物對實驗室的污染。附圖說明圖1是熒光定量PCR的特異性試驗。圖2是熒光定量PCR的敏感性試驗。圖中，1:1XlO6 CFU/25PL;2:1XlO5CFU/25PL;3:1XlO4 CFU/25PL ;4:1XlO3 CFU/25PL ;5:1XlO2 CFU/25PL ;6: 1X10CFU/25PL。具體實施例方式首先無菌操作取25g待測水產品，充分剪碎，放入盛有225mL滅菌海水的滅菌容器中，進行10倍梯度稀釋后，選擇2 3個適當稀釋度，各以0.1mL涂布到TCBS平板上，在360C ±1°〇培養箱中，倒置培養2411±311。挑取5個可疑菌落提取基因組DNA并稀釋備用。如果平板上的可疑菌落少于5個，則應該全部挑取進行基因組DNA提取并稀釋備用。最后進行熒光定量PCR反應，每個熒光定量PCR反應總體積為25PL，其中包括提取的基因組 DNA，2PL ； 10 X PCR buffer, 2.5μ ;Mg2+，2mmol/L ；Taq 酶 2U ；UNG 酶 IU ；dNTP0.2mmol/L ;麥氏弧菌特異性引物IOpmol ;TaqMan探針5pmol,最后加滅菌去離子水至25μ 。設置熒光定量PCR儀器的程序參數為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，同時收集FAM熒光，72°C延伸30s，40個循環。其中麥氏弧菌特異性引物為: 上游引物 Vmetschnikovi1-1:5’- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3’ 下游引物 Vmetschnikovi1-2:5’- CCAAGATGGTCGATATCATC -3’ 特異性TaqMan探針為:Vmetschnikovi1-3:5’- CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT-3’ 熒光定量PCR反應結束后 ，麥氏弧菌能形成典型的S型擴增曲線，而且Ct值〈35。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于Taqman探針的快速檢測水產品中麥氏弧菌的熒光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因組DNA并稀釋備用；再利用麥氏弧菌保守性強的基因組DNA序列設計特異性引物和探針；最后使用該引物和探針對待測水產品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA進行熒光定量PCR擴增和熒光信號的檢測；其中所述的麥氏弧菌特異性引物為：上游引物Vmetschnikovii??1：5“??GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC??3“；下游引物Vmetschnikovii??2：5“??CCAAGATGGTCGATATCATC??3“；特異性TaqMan探針為：Vmetschnikovii?3：5“??CGTAGGTCGTATGAAGTTCAATAGT?3“。
【技術特征摘要】
2012.03.13 CN 201210077610.21.一種基于Taqman探針的快速檢測水產品中麥氏弧菌的熒光定量PCR方法，其特征在于首先提取TCBS平板上的可疑菌落的基因組DNA并稀釋備用；再利用麥氏弧菌保守性強的基因組DNA序列設計特異性引物和探針；最后使用該引物和探針對待測水產品TCBS平板上可疑菌落的基因組DNA進行熒光定量PCR擴增和熒光信號的檢測；其中所述的麥氏弧菌特異性引物為: 上游引物 Vmetschnikovi1-1:5，- GCTATTCGAAAGTTTATTCTTC -3’ ； 下游引物 Vmetschnikovi1-2:5，- CCAAGATGGTCGATATCATC -3’ ； 特異性TaqMan探針為:Vmet...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賈俊濤，吳振興，李正義，祝素珍，姜英輝，馬云，張健，
申請(專利權)人：山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：
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