人抗凝血酶Ⅲ轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法技術

人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法。包括如下步驟：引物及Taqman探針設計，血液基因組DNA的制備，ATIII基因的擴增，ATIII基因的克隆，熒光定量PCR檢測和敏感性評價及定量分析。為了能夠靈敏的檢測到微量的ATIII基因，本研究建立了靈敏、特異的實時熒光定量PCR檢測人ATIIII基因的技術方法，最低能檢測到1copy的ATIII基因，并且檢測特異性高。在此基礎上，開展了抗凝血酶III轉基因羊環境安全性評估的初步研究。完成了與ATIII轉基因羊密切接觸的同種和異種動物血液基因組中ATIII基因的檢測工作(共57個樣本)，結果表明人ATIII基因沒有在轉基因羊和非轉基因羊及其它動物間發生漂移，提示轉基因羊對于環境是安全的。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于對轉基因動物環境安全的檢測和評價領域，具體涉及一種人抗凝血酶 III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法。
技術介紹
隨著生物技術的快速發展，轉基因動物研究的不斷深入和加快，轉基因育種成為培養新品種的重要途徑，商業化轉基因動物即將面世的同時，與轉基因相伴而生的潛在的安全問題已引起世界各國的關注和重視。轉基因動物是通過基因工程技術使生物遺傳信息發生了轉移、替換、融合和表達的遺傳工程體，由于外源基因的插入，打破了原有的育種規律，改變了物種多樣性局面，可能發生潛在的生物環境安全問題，造成重大經濟損失， 對人類生存造成威脅。因此，對轉基因動物環境安全的檢測和評價有利于保證人類健康和生態環境安全、促進轉基因動物相關技術的快速健康發展。基因漂移是指轉基因生物中轉入的外來基因，轉移到相鄰的其他生物之中，從而改變其他生物的基因組成。轉基因植物發生基因漂移可能引起的生態環境安全性問題已經引起廣泛關注，而轉基因動物發生基因漂移的可能性一直沒有被重視。因而研究轉基因動物發生基因漂移的可能性對于評價轉基因動物環境安全性具有重要的意義。本研究建立了實時熒光定量PCR技術檢測抗凝血酶III的技術方法，并充分發揮了申請人青島森淼實業有限公司的轉基因羊資源優勢M，開展抗凝血酶III (ATIII)轉基因羊環境安全性評估的初步研究。
技術實現思路
本專利技術采用如下技術方案實施研究一種人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是包括如下步驟引物及Taqman探針設計，血液基因組DNA的制備，ATIII基因的擴增，ATIII基因的克隆，熒光定量PCR檢測和敏感性評價及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探針設計①利用Primer Primer 5. 0軟件分析人ATIII基因的序列NM_000488，設計并合成用于構建標準質粒的人ATIII特異性引物F5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3',②利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3. 0 軟件設計 Taqman 探針和引物F 5 ’ -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3’，R 5，-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，，Taqman 探針5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，，③利用BLAST在線軟件分析設計引物和探針序列的特異性；(2)血液基因組DNA的制備血樣采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml離心管中4°C保存備用；利用QIAGEN離心柱血液基因組提取試劑盒提取血液基因組；(3)ATIII基因的擴增①以編號A22的轉ATIII基因羊血液基因組為模板；②PCR擴增體系如下DNA模板 10ng，IOXEx Taq bufer 2· 5μ l，dNTP 2. 5mM 5μ1，引物F IOpM ，引物 R IOpM ，Taq 酶 0. 2 μ 1，ddH20 補至Ij 25 μ 1。反應條件為 94°C 5min ;95°C 30S，55°C 30S， 72°C 1. 5min，25個循環；72°C IOmin ；擴增片段大小為1263bp,以瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果并回收；G)ATIII基因的克隆利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒將ATIII基因PCR擴增產物回收，膠回收產物連接到PMD18T載體中，轉化E.coli DH5 α，挑取單克隆，PCR鑒定，并測序鑒定；(5)質粒標準品濃度的計算將上述質粒用紫外分光光度計測定260nm與280nm波長下的OD值，計算DNA濃度并判斷其純度，然后轉換成質粒的拷貝數；(6)熒光定量PCR檢測；(7)敏感性評價及定量分析；(8)特異性評價上述的人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是所述的與標準品對照計算每微升質粒拷貝數的方法是①制備質粒標準品；標準品作10倍梯度稀釋，_20°C保存備用；②樣品質粒用紫外分光光度計測定^Onm與^Onm波長下的OD值，然后按照下面的公式轉換成質粒的拷貝數每微升質粒拷貝數=(質量/ 分子量)X (6. 02 X IO23)= X 10_9/2404697 ]X (6. 02 X IO23個/mol)，其中6. 02 X IO23是阿佛加德羅常數；2404697是標準質粒的分子Mo上述的人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是所述的熒光定量PCR檢測的方法是上述的人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是所述的敏感性評價及定量分析的方法是25 μ 1 反應體系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 緩沖液 12. 5 μ 1，血樣 DNA模板10ng，引物為300nM、探針為250nM，體系用ddH20補齊；特異性反應條件為二溫循環，即95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin, 40個循環；用矩陣法篩選引物和探針的最佳使用量。上述的人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是所述的敏感性評價及定量分析的方法是RNA標準品經1/10系列稀釋，利用建立的檢測體系對不同濃度的RNA標準品進行熒光定量PCR檢測，以確定檢測靈敏度；同時用標準品檢測擴增曲線獲得標準曲線，對檢測樣品進行定量分析。上述的人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是所述的特異性評價的方法是利用建立的檢測體系對編號為A22的轉人ATIII基因羊血液基因組，非轉基因羊血液基因組，和其它對照動物血液基因組，進行熒光定量PCR檢測，以驗證其特異性；上述的人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是所述的采取動物血液基因組樣品的方法是采用頸靜脈取血的方法分別采集轉ATIII基因羊血液基因組血液樣品，轉乙肝表面抗原基因羊血液樣品，轉干擾素轉基因羊血液樣品，野生型山羊血液樣品，家養犬靜脈血液樣品，試驗用小鼠靜脈血液樣品；以及采用翅靜脈采血法采取家養雞血液樣品和家養鵝血液樣品；建立上述各動物血液基因組，進行熒光定量PCR檢測，以驗證人抗凝血酶III轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法的特異性。本專利技術的優點本專利技術的技術方案建立了靈敏、特異的實時熒光定量PCR檢測人ATIII基因的技術方法，最低能檢測到Icopy的ATIII基因，并且檢測特異性高。在此基礎上，開展了抗凝血酶III轉基因羊環境安全性評估的初步研究。完成了與ATIII轉基因羊密切接觸的同種和異種動物血液基因組中ATIII基因的檢測工作(共57 個樣本)。結果表明人ATIII基因沒有在轉基因羊和非轉基因羊及其它動物間發生漂移，提示轉基因羊對于環境是安全的。附圖說明圖1是實施例2的PCR克隆人ATIII基因片段示意圖；圖2是實施例3的熒光定量PCR檢測ATIII標準質粒(1到1 X IO9Copy/ μ 1)的擴增曲線示意圖；圖3是實施例3的定量PCR檢測ATIII的標準曲線示意圖；圖4是實施例3的定量PCR的特異性試驗示意圖；Α、轉ATIII基因羊血液基因組為模板；B、以非轉基因羊和小鼠血液基因組為模板；圖本文檔來自技高網...

【技術保護點】
１．一種人抗凝血酶ＩＩＩ轉基因羊的外源基因漂移風險的分析方法，其特征是包括如下步驟：引物及Ｔａｑｍａｎ探針設計，血液基因組ＤＮＡ的制備，ＡＴＩＩＩ基因的擴增，ＡＴＩＩＩ基因的克隆，熒光定量ＰＣＲ檢測和敏感性評價及定量分析；其中，（１）引物及Ｔａｑｍａｎ探針設計①利用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｉｍｅｒ　５．０軟件分析人ＡＴＩＩＩ基因的序列ＮＭ＿０００４８８，設計并合成用于構建標準質粒的人ＡＴＩＩＩ特異性引物Ｆ５’－ｇｔｇａｔａｇｇａａｃｔｇｔａａｃｃｔ－３’；Ｒ：５’－ｃｇｇｃｃａｇｃａａｔｃａｃａａｃａｇ－３’，②利用Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司的Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　３．０軟件設計Ｔａｑｍａｎ探針和引物Ｆ：５’－ＴＧＴＧＡＴＡＧＧＡＡＣＴＧＴＡＡＣＣＴＣＴＧＧ－３’，Ｒ：５’－ＧＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣ－３’，Ｔａｑｍａｎ探針５’－（ＦＡＭ）ＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧ（Ｅｃｌｉｐｓｅ）－３’，③利用ＢＬＡＳＴ在線軟件分析設計引物和探針序列的特異性；（２）血液基因組ＤＮＡ的制備血樣采用ＥＤＴＡ抗凝，血液置于１．５ｍｌ離心管中４℃保存備用；利用ＱＩＡＧＥＮ離心柱血液基因組提取試劑盒提取血液基因組；（３）ＡＴＩＩＩ基因的擴增①以編號Ａ２２的轉ＡＴＩＩＩ基因羊血液基因組為模板；②ＰＣＲ擴增體系如下：ＤＮＡ模板１０ｎｇ，１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　ｂｕｆｅｒ　２．５μｌ，ｄＮＴＰ　２．５ｍＭ　５μｌ，引物Ｆ　１０ｐＭ，引物Ｒ　１０ｐＭ，Ｔａｑ酶０．２μｌ，ｄｄＨ２Ｏ補到２５μｌ。反應條件為９４℃５ｍｉｎ；９５℃３０Ｓ，５５℃３０Ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，２５個循環；７２℃１０ｍｉｎ；擴增片段大小為１２６３ｂｐ，以１％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果并回收；（４）ＡＴＩＩＩ基因的克隆利用ＤＮＡ瓊脂糖凝膠回收試劑盒將ＡＴＩＩＩ基因ＰＣＲ擴增產物回收，膠回收產物連接到ｐＭＤ１８Ｔ載體中，轉化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α，挑取單克隆，ＰＣＲ鑒定，并測序鑒定；（５）質粒標準品濃度的計算將上述質粒用紫外分光光度計測定２６０ｎｍ與２８０ｎｍ波長下的ＯＤ值，判斷其純度，然后轉換成質粒的拷貝數；（６）熒光定量ＰＣＲ檢測；（７）敏感性評價及定量分析；（８）特異性評價。...

【技術特征摘要】
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：袁三平，顧玉超，鄒賢剛，趙雅琳，
申請(專利權)人：青島森淼實業有限公司，
類型：發明
國別省市：95