TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR技術聯合檢測艱難梭菌菌屬基因及毒素基因的方法學建立技術

Taq?Man/MGB探針PCR技術可對糞便基因組中艱難梭菌進行菌屬鑒定，同時檢測毒素基因攜帶情況，并可判斷A毒素是否存在缺失。糞便標本無需純培養，在一個反應體系內完成菌株鑒定及毒素檢測。本方法具有操作簡單、重復性好、高通量檢測標本、報告時間短等特點，適用臨床不明原因腹瀉病人病因篩查。本發明專利技術解決的技術問題是，糞便標本無需純培養即可同時進行菌屬鑒定及菌株毒素攜帶情況篩查，提供一種高敏感性的糞便基因組DNA中檢測方法。由于傳統厭氧培養不易開展，酶免方法存在方法學缺陷，該發明專利技術將明顯提高艱難梭菌相關性腹瀉的診斷率。同時也可用于上述疾病治療過程中的用藥監測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術專利涉及一種新型艱難梭菌菌屬基因及毒素基因的檢測方法，具體采用TaqMan/MGB探針技術，通過Real-TimePCR分析系統快速進行糞便基因組DNA擴增和熒光信號檢測，同時完成艱難梭菌菌屬鑒定，A、B毒素基因檢測及鑒別A毒素是否存在缺失。
技術介紹
艱難梭菌一直是引起醫源性腹瀉的主要病原體，由于廣譜抗生素的大量使用以及高毒力株027/NAP1/BI (核酸分型為027，脈沖場凝膠電泳分型為NAP1，限制性內切酶分型為BI)的出現和流行，全球特別是歐洲和北美⑶I的流行暴發迅速增多，嚴重病例數、復發率和病死率均明顯上升，耐藥菌株也在增多，給該病的臨床診斷和治療提出新的挑戰。診斷CDI的早期臨床診斷須結合患者的不成形便和特殊氣味及2個月內的抗生素使用史，或者接受鼻飼等醫療設備治療72h后出現腹瀉。目前，實驗室檢測艱難梭菌的方法主要為細菌的厭氧培養，通過對疑似菌落進行生化鑒定確定細菌種屬。而常規厭氧培養除需要昂貴的厭氧設備，該方法對 標本留取也具有極其嚴格的要求(標本離體后必須放置在厭氧環境中，在有氧環境下，標本離體后30min幾乎100%培養陰性)，而生化鑒定比較繁瑣，更須具備較好的技術與經驗。有時由于區分菌株的生化鑒定結果的一致性不好以及存在個別的非典型菌株，可能會造成分離菌株的錯誤鑒定。除上述經典方法外，目前一些實驗室也采用酶免疫方法檢測艱難梭菌毒素，雖然該方法操作簡便快速，但受到靈敏度不高和存在交叉反應等限制。質譜檢測厭氧菌方便快速準確，但儀器成本與熒光定量PCR儀相比較昂貴，其最大的問題是需要將標本純培養后獲得單個菌落進行檢測?；赑CR檢測艱難梭菌的方法大多數為普通PCR擴增加瓊脂糖凝膠電泳進行測定，方法操作繁瑣。采用RT-PCR進行檢測，且菌屬鑒定與毒素篩查同時進行的方法國內未見報道。臨床艱難梭菌相關性腹瀉患者分離出的菌株通常可產生A和B兩種毒素。但是，臨床分離的部分菌株為A-B+菌株,其A毒素編碼基因存在部分缺失,導致A毒素無法使用常規的酶標免疫學方法檢測出來。由于B毒素潛在的腸毒素活性或與其他毒素聯合作用，該種A-B+菌株仍然可以導致嚴重的艱難梭菌相關性腹瀉。由于厭氧菌檢測不易開展，國內未見大規模詳細的流調資料。僅上海，北京兩地醫院對艱難梭菌或耐藥性、或毒素攜帶方面做過單一調查。中國上海醫院的一項研究顯示，在分離出的初次感染的56株艱難梭菌產毒株中，有13株A-B+菌株，比例為23.2%。程穎等人報道在分離出的8株艱難梭菌產毒株中，有3株A-B+菌株，比例為37.5%。研究也表明，A-B+菌株對克林霉素的耐藥性高達85%，較A+B+菌株對克林霉素的耐藥性顯著增高。由此可見，A-B+菌株在中國具有發病比例高，隱蔽性強，耐藥性高的特點，對臨床科室的危害性更為嚴重。提高并改進臨床實驗室對艱難梭菌的檢測，建立一種無需培養、方便、快捷、可操作、高通量、易于開展的艱難梭菌診斷方法，尤其是可對A-B+型艱難梭菌進行篩查勢在必行。
技術實現思路
本專利技術專利需要解決的技術問題是，糞便標本無需純培養，直接提取糞便基因組DNA,同時進行菌屬鑒定及菌株毒素攜帶情況檢測。本專利技術專利主要采用了 TaqMan/MGB探針技術，通過Real-Time PCR分析系統建立了一種快速、簡便、高通量、一次性檢測糞便基因組DNA中艱難梭菌菌屬鑒定、毒素攜帶情況及A毒素是否存在缺失的方法。具體實施例方式1.基因庫檢索，序列比對，篩選特異序列2.設計探針及引物。3.優化反應條件。4.PCR反應體系中各種試劑的濃度配制。5.對建立的TaqM an/MGB探針PCR技術進行驗證，從檢測特異度、靈敏度及其抗干擾性等方面評價該檢測方法。6.通過對臨床不明原因腹瀉病人糞便基因組艱難梭菌菌屬鑒定及毒素攜帶情況篩查，與傳統菌屬鑒定及毒素檢測的酶免疫方法比對，評價本專利技術專利的準確性及優勢。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
本專利技術是一種方便、快速、高敏感性的在糞便基因組DNA中直接檢測艱難梭菌菌屬基因磷酸丙糖異構酶(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的方法，其技術核心為TaqMan/MGB探針結合實時熒光定量PCR技術，包括：基因庫檢索，tpi、tcdA、tcdAt、tcdB特異性序列比對，篩選特異序列，引物和探針設計，PCR反應參數優化。其特征在于：糞便標本無需純培養，直接檢測糞便DNA中艱難梭菌tpi、tcdA、tcdAt和tcdB基因，可從菌屬鑒定、毒素鑒定及A毒素是否有缺失3個方面對艱難梭菌進行同時鑒定判斷，具有靈敏度高、特異性強，檢測時間短(1.5小時)、操作簡單、重復性好、高通量等特點。

【技術特征摘要】
1.本發明是一種方便、快速、高敏感性的在糞便基因組DNA中直接檢測艱難梭菌菌屬基因磷酸丙糖異構酶(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的方法,其技術核心為TaqMan/MGB探針結合實時熒光定量PCR技術，包括:基因庫檢索，tp1、tcdA、tcdAt、tcdB特異性序列比對，篩選特異序列，引物和探針設計，PCR反應參數優化。其特征在于:糞便標本無需純培養，直接檢測糞便DNA中艱難梭菌tp1、tcdA、tcdAt和tcdB基因,可從菌屬鑒定、毒素鑒定及A毒素是否有缺失3個方面對艱難梭菌進行同時鑒定判斷，具有靈敏度高、特異性強，檢測時間短(1.5小時)、操作簡單、重復性好、高通量等特點。2.根據權利要求1所述本發明是檢測艱難梭菌菌屬基因(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的新方法，其特征在于:基因庫檢...

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁國威，邵冬華，
申請(專利權)人：航天中心醫院，
類型：發明
國別省市：