本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種20個(gè)X-SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測(cè)的分型方法，屬于醫(yī)學(xué)親緣關(guān)系鑒定技術(shù)領(lǐng)域。其包括下述步驟：（1）DNA溶液的制備；（2）擴(kuò)增；（3）純化擴(kuò)增產(chǎn)物；（4）延伸反應(yīng)；（5）純化延伸產(chǎn)物；（6）檢測(cè)、確定延伸產(chǎn)物。本發(fā)明專利技術(shù)使待測(cè)靶DNA的片段范圍縮短至61～99bp，提高對(duì)高度降解DNA分型的成功率，能夠解決親祖關(guān)系、半同胞關(guān)系、同胞關(guān)系等復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定的難題。對(duì)復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定以及高度降解檢材DNA的法醫(yī)學(xué)分型方面具有很大的優(yōu)勢(shì)和潛力。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)親緣關(guān)系鑒定
技術(shù)介紹
X染色體具有伴性遺傳和交叉遺傳的獨(dú)特的遺傳學(xué)特征，對(duì)于解決法醫(yī)實(shí)踐中的父女鑒定、母子鑒定、姐妹鑒定、同父異母姐妹鑒定、隔代鑒定等復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定，具有十分重要的意義。目前法醫(yī)DNA檢測(cè)主要針對(duì)短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)以及單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)分型。復(fù)合擴(kuò)增體系中，STR的擴(kuò)增片段一般較大，不利于降解檢材的分析，同時(shí)一些常用的STR基因座突變率較高，使親子鑒定面臨錯(cuò)判的風(fēng)險(xiǎn)。而SNP具有分布廣泛，易于開展高通量自動(dòng)化分型等優(yōu)點(diǎn)，可以在短至45-55bp (變異位點(diǎn)兩側(cè)引物序列長(zhǎng)度)的擴(kuò)增片段內(nèi)分型，更適于降解檢材的分析，同時(shí)SNP的突變率低，對(duì)法醫(yī)親緣關(guān)系鑒定更有價(jià)值，因此SNP在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊前景。親緣關(guān)系鑒定是司法實(shí)踐中的重要內(nèi)容之一。目前應(yīng)用常染色體遺傳標(biāo)記作為進(jìn)行檢測(cè)，基本能夠解決大部分親緣關(guān)系鑒定案例。但對(duì)于一些特殊案例，如祖母與孫女的親祖關(guān)系鑒定、同父異母姐妹的半同胞關(guān)系鑒定、同胞鑒定、以及涉及父女及母子的單親關(guān)系鑒定，就需要借助于X染色體遺傳標(biāo)記的分型技術(shù)。X染色體的遺傳特征表現(xiàn)為伴性遺傳和交叉遺傳。男性個(gè)體X染色體每個(gè)基因座顯現(xiàn)一條等位基因片段，來自母親并傳遞給女兒，女性個(gè)體X染色體每個(gè) 基因座顯示兩條等位基因片段，一條來自父親，一條來自母親。因此，在判定上述這些較復(fù)雜的親緣關(guān)系中，X染色體遺傳標(biāo)記可以提供一些特殊的信息，作為常染色體遺傳標(biāo)記的重要補(bǔ)充。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供一種20個(gè)X-SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測(cè)的分型方法，使待測(cè)靶DNA的片段范圍縮短至61 99bp，提高對(duì)高度降解DNA分型的成功率，能夠解決親祖關(guān)系、半同胞關(guān)系、同胞關(guān)系等復(fù)雜未緣關(guān)系鑒定的難題。對(duì)復(fù)雜未緣關(guān)系鑒定以及聞度降解檢材DNA的法醫(yī)學(xué)分型方面具有很大的優(yōu)勢(shì)和潛力。本專利技術(shù)所采取的技術(shù)方案是: 20個(gè)X-SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測(cè)的分型方法，包括下述步驟: (1)DNA溶液的制備:提取DNA，制備DNA溶液； (2)擴(kuò)增:在擴(kuò)增體系中加入步驟(I)所得的DNA溶液，然后在擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95°C、5min預(yù)變性；然后依次在95°C、30s，58°C、30s，65°C、30s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；再在65°C保持7min ;最終在4°C保存，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；所述擴(kuò)增體系包括:PCR緩沖溶液、MgCl2、dNTPs、PCR 引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA ； (3)純化擴(kuò)增產(chǎn)物:應(yīng)用核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化反應(yīng)條件:37°C、lh，然后80°C、15min，最終在4°C保存，得純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)延伸反應(yīng):將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至延伸反應(yīng)試劑中進(jìn)行延伸反應(yīng)；延伸反應(yīng)的條件:依次在96°C、10s，50°C、5s，6(rC、30s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最終保存在4°C，得延伸產(chǎn)物；所述的延伸反應(yīng)試劑為延伸引物和SNaPshot反應(yīng)混合液； (5)純化延伸產(chǎn)物:將延伸產(chǎn)物加入至蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液的混合液中，在下列條件下進(jìn)行純化反應(yīng):37°C、lh，80°C、15min，最終保存在4°C，得純化后的延伸產(chǎn)物； (6)檢測(cè)、確定延伸產(chǎn)物 將步驟(5)中得到的純化后的延伸產(chǎn)物中加入至測(cè)試試劑中，混勻；檢測(cè)條件:15000V電壓，36cm毛細(xì)管，P0P4凝膠，電泳20min ;最后根據(jù)延伸產(chǎn)物峰的位置和顏色確定20個(gè)X-SNP位點(diǎn)的基因型；所述的測(cè)試試劑為H1-Di甲酰胺和GeneScan Size Standards-120LIZ ； 其中，步驟(2 )中同時(shí)復(fù)合擴(kuò)增包含20個(gè)X-SNPs位點(diǎn)的DNA片段。所述的PCR引物和延伸引物由20個(gè)X-SNP位點(diǎn)的引物組成，所述20個(gè)X-SNP位點(diǎn)在 NCBI 中 SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)的 rs 號(hào)分別為 rs5916197, rs757018, rs2071182, rs5951622,rs4898214, rs5963947, rs5906341, rs4826645, rs3860291, rs5912774, rsl988916,rs5941046, rs4463614, rs5916844, rs6568051, rs2522169, rs5930646, rs5929739,rs5908051，rs6627351 ； 20個(gè)X-SNP位點(diǎn)的PCR弓丨物和延伸弓丨物的序列見表I。根據(jù)NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP )提供的DNA序列，設(shè)計(jì)20個(gè)X-SNP位點(diǎn)的PCR引物，PCR引物長(zhǎng)度18 28個(gè)堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度61 99bp，各位點(diǎn)單獨(dú)擴(kuò)增退火溫度59°C，GC含量:35.7_55%。又設(shè)計(jì)了延伸引物，延伸引物的3’末端位于多態(tài)性位點(diǎn)的上游I個(gè)堿基處，延伸引物與模板DNA互補(bǔ)部分的特異性引物長(zhǎng)度18 26個(gè)堿基。同一反應(yīng)管中，檢測(cè)相同突變的延伸引物長(zhǎng)度相差3 12個(gè)堿基，為了改變引物的長(zhǎng)度，區(qū)分不同的位點(diǎn)，在特異性引物的5’端加“加尾”序列為“poly-CT” 序列和 “5' -AACTGACTAAACTAGGTGCCACGTCGTGAAAGTCTGACAA-3' ” 序列。表I 20個(gè)X-SNP位點(diǎn)的PCR引物和延伸引物的序列表本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種20個(gè)X?SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測(cè)的分型方法，其特征在于包括下述步驟：（1）DNA溶液的制備：提取DNA，制備DNA溶液；（2）擴(kuò)增：在擴(kuò)增體系中加入步驟（1）所得的DNA溶液，然后在擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃、5min預(yù)變性；然后依次在95℃、30s,?58℃、30s，65℃、30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；再在65℃保持7min；最終在4℃保存，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；所述擴(kuò)增體系包括：PCR緩沖溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq?DNA聚合酶、模板DNA；（3）純化擴(kuò)增產(chǎn)物：應(yīng)用核酸外切酶Ⅰ和蝦堿性磷酸酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化反應(yīng)條件：37℃、1h，然后80℃、15min，最終在4℃保存，得純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物；（4）延伸反應(yīng)：將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至延伸反應(yīng)試劑中進(jìn)行延伸反應(yīng)；延伸反應(yīng)的條件：依次在96℃、10s，50℃、5s，60℃、30s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最終保存在4℃，得延伸產(chǎn)物；所述的延伸反應(yīng)試劑為延伸引物和SNaPshot反應(yīng)混合液；（5）純化延伸產(chǎn)物：將延伸產(chǎn)物加入至蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液的混合液中，在下列條件下進(jìn)行純化反應(yīng)：37℃、1h，80℃、15min，最終保存在4℃，得純化后的延伸產(chǎn)物；（6）檢測(cè)、確定延伸產(chǎn)物將步驟（5）中得到的純化后的延伸產(chǎn)物中加入至測(cè)試試劑中，混勻；檢測(cè)條件：15000V電壓，36cm毛細(xì)管，POP4凝膠，電泳20min；最后根據(jù)延伸產(chǎn)物峰的位置和顏色確定20個(gè)X?SNP位點(diǎn)的基因型；所述的測(cè)試試劑為Hi?Di甲酰胺和GeneScanTM?Size?Standards?120?LIZ；所述的PCR引物和延伸引物由20個(gè)X?SNP位點(diǎn)的引物組成，所述20個(gè)X?SNP位點(diǎn)在NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫(kù)的rs號(hào)分別為rs5916197，rs757018，rs2071182，rs5951622，rs4898214，rs5963947，rs5906341，rs4826645，rs3860291，rs5912774，rs1988916，rs5941046，rs4463614，rs5916844，rs6568051，rs2522169，rs5930646，rs5929739，rs5908051，rs6627351；所述20個(gè)X?SNP位點(diǎn)的PCR引物及延伸引物序列為：。673046dest_path_image002.jpg,590187dest_path_image004.jpg,307607dest_path_image006.jpg...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種20個(gè)X-SNP位點(diǎn)多色熒光復(fù)合檢測(cè)的分型方法，其特征在于包括下述步驟: (1)DNA溶液的制備:提取DNA，制備DNA溶液； (2)擴(kuò)增:在擴(kuò)增體系中加入步驟(I)所得的DNA溶液，然后在擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95°C、5min預(yù)變性；然后依次在95°C、30s，58°C、30s，65°C、30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；再在65°C保持7min ;最終在4°C保存，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；所述擴(kuò)增體系包括:PCR緩沖溶液、MgCl2、dNTPs、PCR 引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA ； (3)純化擴(kuò)增產(chǎn)物:應(yīng)用核酸外切酶I和蝦堿性磷酸酶純化擴(kuò)增產(chǎn)物，純化反應(yīng)條件:37°C、lh，然后80°C、15min，最終在4°C保存，得純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物； (4)延伸反應(yīng):將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物加入至延伸反應(yīng)試劑中進(jìn)行延伸反應(yīng)；延伸反應(yīng)的條件:依次在96°C、10s，50°C、5s，6(rC、30s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最終保存在4°C，得延伸產(chǎn)物；所述的延伸反應(yīng)試劑為延伸引物和SNaPshot反應(yīng)混合液； (5)純化延伸產(chǎn)物:將延伸產(chǎn)物加入至蝦堿性磷酸酶及其緩沖溶液的混合液中，在下列條件下進(jìn)行純化反應(yīng):37°C、lh，80°C、15min，最終保存在4°C，得純化后的延伸產(chǎn)物； (...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：叢斌，李淑瑾，王茜，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河北醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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