一種InDel位點基因型分型的方法技術

本發明專利技術提供了一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：1)將目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列，將所述目的基因克隆產物序列進行多重比對，得到InDel位點；2)根據所述InDel位點設計PCR擴增引物，所述PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團修飾；3)用所述PCR擴增引物對待測樣本DNA進行PCR擴增獲得擴增產物，用毛細管熒光凝膠電泳檢測擴增產物確定所述待測樣本中InDel位點的基因型。本發明專利技術提供的基因型分型方法，成本低、操作簡單靈活、結果準確。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學
，尤其涉及一種InDel位點基因型分型的方法。
技術介紹
插入缺失(InsertionandDeletion，簡稱InDel)是指同源序列的比對中出現的至少1bp核苷酸的差異，這種差異稱為InDels；InDel在基因組中的含量僅次于單核苷酸多態性(SNP)標記，具有數量多、分布廣泛、變異豐富等特點。根據基因組中插入缺失位點，設計擴增這些插入缺失位點的PCR引物，產生的多態性位點即為插入缺失(InDel)標記。插入缺失(InDel)標記在系統發育推斷、遺傳診斷、藥物設計等方面具有重要的應用潛力。目前，常用的InDel分型方法主要是測序法和芯片法，測序法和芯片法實驗操作繁瑣、效率較低并且依賴相關大型儀器平臺作為支撐，費用昂貴。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種成本低、操作簡單靈活、準確的基因型分型的方法。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：本專利技術提供了一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：1)將目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列，將所述目的基因克隆產物序列進行多重比對，得到InDel位點；2)根據所述InDel位點設計PCR擴增引物，所述PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團修飾；3)用所述PCR擴增引物對待測樣本全基因組DNA進行PCR擴增獲得擴增產物，用毛細管熒光凝膠電泳檢測擴增產物，若擴增產物中有兩條條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。優選的，所述熒光基團為FAM或HEX。優選的，所述多重比對采用MEGA軟件中的ClustalW模塊。優選的，所述待測樣本為楊木樹種。優選的，所述目的基因為尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1。優選的，所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1上的InDel位點分別為InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第401bp到409bp處，所述InDel2位于第1399bp到1401bp處，InDel3位于第1427bp到1438bp，InDel4位于第2094bp到2103bp處，InDel5位于第4143bp到4152bp。優選的，根據InDel1設計的引物為正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2；根據InDel2和InDel3設計的引物為正向引物SEQIDNO.3和反向引物SEQIDNO.4；根據InDel4設計的引物為正向引物SEQIDNO.5和反向引物SEQIDNO.6；根據InDel5設計的引物為正向引物SEQIDNO.7和反向引物SEQIDNO.8。優選的，步驟3)中所述PCR擴增的條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，53～57℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；最后72℃延伸5min。優選的，所述PCR擴增用擴增體系包括以下組分：0.7μl的待測樣品全基因組DNA，0.15μl的0.8UTaq酶，0.3μl0.2mM的dNTPs，0.9μl25mM的MgCl2，1.25μl的10×PCRbuffer，0.4μl100nmolL-1的正向引物和0.4μl100nmolL-1反向引物和8.4μl的ddH2O。優選的，所述基因組DNA的濃度為5～20ng/μl。本專利技術的有益效果：本專利技術提供的InDel位點基因型分型的方法通過多重比對獲得目的基因InDel位點，根據InDel位點設計PCR擴增引物，包括正向引物和反向引物，采用熒光基團修飾正向引物的5’端，然后對待測樣本DNA進行PCR擴增，用毛細管熒光凝膠電泳檢測擴增產物確定所述待測樣本中InDel位點的基因型。本專利技術對引物組中的正向引物5'末端采用熒光基團進行修飾，可顯著地保留熒光信號強度、減少InDel位點的非特異性擴增，提高了基因型檢測的準確度；同時極大地簡化了實驗步驟和配套條件，并顯著地降低了實驗成本。進一步的，在適宜退火溫度和PCR反應條件下，進一步提高熒光信號強度，提高基因型檢測的準確度。附圖說明圖1為實施例1中毛細管熒光凝膠電泳結果圖。具體實施方式本專利技術提供了一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：1)將目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列，將所述目的基因克隆產物序列進行多重比對，得到InDel位點；2)根據所述InDel位點設計PCR擴增引物，所述PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團修飾；3)用所述PCR擴增引物對待測樣本DNA進行PCR擴增獲得擴增產物，毛細管熒光凝膠電泳檢測擴增產物，若擴增產物中有兩條目的條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條目的條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條目的條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。本專利技術提供的InDel位點基因型分型的方法適用于林木樹種，優選的為楊木樹種，如本專利技術的實施例中所用毛白楊。本專利技術將目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列。本專利技術中所述的目的基因為待測樣品的任一基因，優選的為尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1，優選的所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1的序列如SEQIDNO.9所示。在本專利技術選定目的基因后，將所述目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列。本專利技術對所述的T載體克隆測序的具體步驟沒有特殊限定，采用本領域常規的T載體轉化大腸桿菌DH52感受態細胞克隆測序方法步驟即可。得到目的基因克隆產物序列后，本專利技術將所述目的基因克隆產物序列進行多重比對，得到InDel位點。在本專利技術中，所述的多重比對優選的采用MEGA軟件中的ClustalW模塊，具體的多重比對的參數優選的為軟件模塊中的默認參數。具體的在本專利技術實施例中以尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1為目的基因，對目的基因進行T載體克隆測序，后采用MEGA軟件中的ClustalW模塊進行多重比對，確定的InDel位點有5個，分別為InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第401bp到409bp處，所述InDel2位于第1399bp到1401bp處，InDel3位于第1427bp到1438bp，InDel4位于第2094bp到2103bp處，InDel5位于第4143bp到4152bp。本專利技術在獲得上述InDel位點后，分別根據上述InDel位點設計引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團修飾。優選的根據InDel1設計的引物為正向引物SEQIDNO.1和反向引物SEQIDNO.2；正向引物的序列為UXS1ID1F:5'-CTCCCGCCTTAACCCATCT-3'；反向引物的序列為UXS1ID1R:5'-GTAACCACGATACGCAAACTC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：1)將目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列，將所述目的基因克隆產物序列進行多重比對，得到InDel位點；2)根據所述InDel位點設計PCR擴增引物，所述PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團修飾；3)用所述PCR擴增引物對待測樣本全基因組DNA進行PCR擴增獲得擴增產物，用毛細管熒光凝膠電泳檢測擴增產物，若擴增產物中有兩條條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。

【技術特征摘要】
1.一種InDel位點基因型分型的方法，包括以下步驟：1)將目的基因DNA序列進行T載體克隆測序，得到目的基因克隆產物序列，將所述目的基因克隆產物序列進行多重比對，得到InDel位點；2)根據所述InDel位點設計PCR擴增引物，所述PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的5'末端采用熒光基團修飾；3)用所述PCR擴增引物對待測樣本全基因組DNA進行PCR擴增獲得擴增產物，用毛細管熒光凝膠電泳檢測擴增產物，若擴增產物中有兩條條帶則該InDel位點的基因型為雜合型ID；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中大的片段相同，則該InDel位點基因型為插入純合型II；若有一條條帶且片段大小與雜合型ID中小的片段相同，則表示該InDel位點為缺失純合型DD。2.根據權利要求1所述InDel位點基因型分型的方法，其特征在于，所述熒光基團為FAM或HEX。3.根據權利要求1所述InDel位點基因型分型的方法，其特征在于，所述多重比對采用MEGA軟件中的ClustalW模塊。4.根據權利要求1所述InDel位點基因型分型的方法，其特征在于，所述待測樣本為楊木樹種。5.根據權利要求1或4所述InDel位點基因型分型的方法，其特征在于，所述目的基因為尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1。6.根據權利要求5所述InDel位點基因型分型的方法，其特征在于，所述尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1上的InDel位點分別為InDel1、InDel2、InDel3、InDel4和InDel5；所述InDel1位于尿苷二磷酸葡糖醛酸脫羧酶基因1全長第401b...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張德強，鞏琛銳，杜慶章，
申請(專利權)人：北京林業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11