SNP位點基因型分型的方法技術

本發明專利技術公開了一種SNP位點基因型分型的方法。該方法包括以下步驟：S1，對目標區域的DNA序列進行克隆測序和多重比對，確定待測SNP位點；S2，針對SNP位點設計PCR擴增引物，PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對應待測SNP位點，將對應待測SNP位點的3'末端上的核苷酸進行LNA修飾；S3，采用PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增，并根據擴增產物中目的條帶的有無確定待測樣本的SNP位點基因型。應用本發明專利技術的技術方案，采用鎖核酸引物進行PCR擴增以確定SNP位點的基因型，不僅增加了檢測結果的精確性和可靠性，而且極大地提高了實驗的靈活性，簡化了配套條件并顯著地降低了實驗成本。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種SNP位點基因型分型的方法。該方法包括以下步驟：S1，對目標區域的DNA序列進行克隆測序和多重比對，確定待測SNP位點；S2，針對SNP位點設計PCR擴增引物，PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對應待測SNP位點，將對應待測SNP位點的3'末端上的核苷酸進行LNA修飾；S3，采用PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增，并根據擴增產物中目的條帶的有無確定待測樣本的SNP位點基因型。應用本專利技術的技術方案，采用鎖核酸引物進行PCR擴增以確定SNP位點的基因型，不僅增加了檢測結果的精確性和可靠性，而且極大地提高了實驗的靈活性，簡化了配套條件并顯著地降低了實驗成本。【專利說明】SNP位點基因型分型的方法
本專利技術涉及分子生物學
，具體而言，涉及一種SNP位點基因型分型的方 法。
技術介紹
鎖核酸（Locked nucleic acid, LNA)是指核苷酸糖環上的2' -〇與4' -C由亞甲 基橋相連的一類RNA衍生物，可以與DNA或RNA按照一般的堿基配對原則進行配對。這 種橋連結構增加了核酸骨架的穩定性，提高了退火溫度，增強了堿基配對的特異性，極 大的降低了錯配發生的概率。因此鎖核酸在基因芯片、RNA干擾等許多領域得到了廣泛 的應用（Braasch, D. A. and D. R. Corey, Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chemistry&biology, 2001. 8(I):p. 1-7. )〇 理論上，聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR)的順利進行是以模 板單鏈與引物鏈按照堿基配對原則正確配對為前提。所以，在包含堿基差異的區域，設計一 組只有單堿基差異的PCR引物，利用常見的PCR擴增儀，進行擴增，檢測是否有符合設計片 段長度的擴增產物產生，可以判斷目標區域靶位點的堿基類型。但在使用常規PCR引物時， 即使存在單堿基的錯配，PCR反應有時也可以正常進行，得到與目的片段長度相同的擴增產 物。因而使用常規引物進行PCR擴增分型時，無法排除假陽性結果，進而可能會得到錯誤的 基因型分型結果。 目前，常用的SNP位點基因型檢測方法主要有測序法、芯片法以及質譜法等，其中 測序法價格比較昂貴，而芯片法和質譜法只有在同時測定多個位點或研究大群體樣品時較 有優勢，且這三種方法都必須以相關的大型儀器平臺作為支撐，存在多種局限。
技術實現思路
本專利技術旨在提供一種SNP位點基因型分型的方法，以解決現有技術中SNP位點基 因型分型技術假陽性高或復雜、價格昂貴的技術問題。 為了實現上述目的，根據本專利技術的一個方面，提供了一種SNP位點基因型分型的 方法。該方法包括以下步驟：S1，對目標區域的DNA序列進行克隆測序和多重比對，確定待 測SNP位點；S2，針對SNP位點設計PCR擴增引物，PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的 3'末端對應待測SNP位點，對對應待測SNP位點的3'末端上的核苷酸進行LNA修飾；S3， 采用PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增，并根據擴增產物中目的條帶的有無確定待 測樣本的SNP位點基因型。 優選地，步驟S3中采用PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增是在通過梯度實 驗得到的最佳PCR擴增條件和反應體系下進行的。 優選地，對PCR擴增引物中的與模板雜交親和程度高的引物3'末端進行LNA修 飾。 優選地，PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒數第一個或倒數第二 個核苷酸對應待測SNP位點。 優選地，待測樣本為毛白楊，待測SNP位點位于纖維素合酶基因5上，PCR擴增引 物的堿基序列為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 3 ;SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO: 2 的3'末端上的倒數第一個核苷酸進行LNA修飾。 優選地，待測樣本為毛白楊，待測SNP位點位于纖維素合酶基因5上，PCR擴增引 物的堿基序列為 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 ;SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 的3'末端上的倒數第一個核苷酸進行LNA修飾。 優選地，待測樣本為毛白楊，待測SNP位點位于纖維素合酶基因8上，PCR擴增引 物的堿基序列為 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 ;SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 的3'末端上的倒數第二個核苷酸進行LNA修飾。 優選地，PCR擴增的條件為：預變性95°C 5min，變性95°C 30s，退火58?65°C 30s 或20s，延伸72°C lmin，30個循環，最后延伸72°C 10min。 優選地，PCR 擴增的體系為：20ng 基因組 DNA，0.8UTaq 酶，0.2mMdNTPs，10XPCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，補充水至25 μ 1。 由于錯配現象的存在，普通的PCR擴增引物與模板DNA鏈無法進行完全正確的雜 交結合，也就意味著無法通過檢測PCR擴增產物的有無來判斷靶位點的核苷酸類型。為了 解決這一技術問題，應用鎖核酸修飾的技術手段，對引物組中的單堿基差異核苷酸進行修 飾，在最佳的退火溫度和PCR反應條件下，可以顯著地提高PCR擴增引物與模板DNA鏈集合 的特異性，使其完全正確的遵循堿基配對原則進行PCR擴增，以達到通過檢測擴增產物的 有無來判斷靶位點核苷酸類型的目的，實現待檢測SNP位點的基因型分型。也就是說，應用 本專利技術的技術方案，采用鎖核酸引物進行PCR擴增以確定SNP位點的基因型，不僅增加了檢 測結果的精確性和可靠性，而且極大地提高了實驗的靈活性，簡化了配套條件并顯著地降 低了實驗成本。 【專利附圖】【附圖說明】 構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本專利技術的進一步理解，本專利技術的示 意性實施例及其說明用于解釋本專利技術，并不構成對本專利技術的不當限定。在附圖中： 圖1示出了實施例1中退火溫度梯度PCR擴增產物電泳結果圖，G :使用正向引物 C5SNP1GF和反向引物C5SNP1R的PCR擴增產物點樣泳道，T :使用正向引物C5SNP1TF和反 向引物C5SNP1R的PCR擴增產物點樣泳道。 【具體實施方式】 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本專利技術。 針對現有技術中SNP位點基因型分型技術假陽性高或復雜、價格昂貴的技術問 題，本專利技術的專利技術人利用鎖核酸的特性改進了 SNP位點基因型分型方法，對引物組中的引 物，僅在差異位點以相應的鎖核酸取代對應的普通核苷酸，合成特殊的鎖核酸引物，進行 PCR擴增，以檢測目的長度片段是否存在來推斷差異位點的基因型類型，來取得可信的SNP 基因型檢測結果。 根據本專利技術一種典型的實施方式，提供一種SNP位點基因型本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種SNP位點基因型分型的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1，對目標區域的DNA序列進行克隆測序和多重比對，確定待測SNP位點；S2，針對所述SNP位點設計PCR擴增引物，所述PCR擴增引物中的正向引物或反向引物的3'末端對應所述待測SNP位點，將對應所述待測SNP位點的所述3'末端上的核苷酸進行LNA修飾；S3，采用所述PCR擴增引物對待測樣本的DNA進行擴增，并根據擴增產物中目的條帶的有無確定所述待測樣本的SNP位點基因型。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張德強，徐煲鏵，杜慶章，
申請(專利權)人：北京林業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11