一種大腸桿菌 O26、O45、O121血清型三重PCR檢測試劑盒及其引物組制造技術

本發明專利技術公開了一種大腸桿菌O26、O45、O121血清型檢測試劑盒及其檢測方法。本發明專利技術所述試劑盒3對引物組能在同一反應體系能進行有效擴增。實驗表明，本發明專利技術所述含該引物組的檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前大腸桿菌O26、O45、O121血清分型檢測方法上的不足，可以滿足當前大腸桿菌O26、O45?O121血清型分型的檢測需求，易于大范圍推廣應用，適用于食源性致病菌的初篩選，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種大腸桿菌O26、O45、O121血清型檢測試劑盒及其檢測方法。本專利技術所述試劑盒3對引物組能在同一反應體系能進行有效擴增。實驗表明，本專利技術所述含該引物組的檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前大腸桿菌O26、O45、O121血清分型檢測方法上的不足，可以滿足當前大腸桿菌O26、O45 O121血清型分型的檢測需求，易于大范圍推廣應用，適用于食源性致病菌的初篩選，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。【專利說明】一種大腸桿菌〇26、045、0121血清型三重PCR檢測試劑盒及其 引物組
本專利技術屬于生物檢測
，具體涉及一種大腸桿菌026、045、0121血清型檢測 試劑盒及其引物組。
技術介紹
大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年 發現的，在相當長的一段時間內，一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。 直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒 和幼畜（禽），常引起嚴重腹瀉和敗血癥。產志賀氏毒素大腸桿菌是重要的食源性致病源，嚴 重危害公共健康。〇157:H7可以導致腹瀉、出血性腸炎，尿毒血癥等臨床癥狀。近年來，產志 賀毒素而非0157的大腸桿菌，尤其是被美國農業部稱為"the Big Six"的6種大腸桿菌在諸 多國家及地區暴發流行，嚴重威脅人類的健康，越來越受到世界各國的關注。"the Big Six"包括大腸桿菌026、045、0103、0111、0121、0145等6種血清型。 據統計，在美國由non-0157 STEC引起的患病病例中，有71%是由026、045、0103、 0111、0121、0145血清型引起的。為了保障人類的健康和牛肉市場的正常供應，2011年9月， 美國農業部頒布了一項禁止出售帶有大腸桿菌"the Big Six"（026、045、0103、0111、0121、 0145)牛肉制品的法令?；谖覈壳罢莆盏氖吃葱约膊『惋L險監測資料，對高危食品（牛 肉制品和即食果蔬)和高致病性血清型(〇157:H7)進行了嚴格的規定和限量要求，但未對其 他血清型的STEC作明確的要求。有助于開展大腸桿菌026,045,0103,0111,0121,0145血清 型風險監測和風險評估的檢測技術相對滯后。 大腸桿菌抗原復雜，主要有菌體抗原(0)、莢膜抗原(K)、鞭毛抗原(H)和菌毛抗原 (F)等，大腸桿菌表面抗原0-抗原是刺激機體產生先天性免疫和獲得性免疫的重要毒力因 子，在大腸桿菌的致病性過程中起著重要的作用。針對于〇抗原的傳統血凝試驗是檢測血清 型的主要方法，該方法費時、費力，PCR檢測技術在大腸桿菌血清型檢測過程得到發展和應 用，目前國內，針對〇26、045、0121血清型多重PCR檢測方法還未見報道，因此，本專利技術研究人 員研究一種多重PCR檢測方法應用于026、045、0121血清型的檢測，該方法省時、省力、特異 性和敏感性高，適用于推廣應用。 本專利技術公開了一種大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒及其檢測方法。本發 明所述試劑盒3對引物組能在同一反應體系能進行有效擴增?，F有技術中雖然也有其它檢 測試劑盒，但實驗表明，本專利技術所述含該引物組的檢測試劑盒及其檢測方具有快速、敏感、 特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前大腸桿菌〇26、045、0121血清分型檢測 方法上的不足，可以滿足當前大腸桿菌026、045、0121血清型分型的檢測需求，易于大范圍 推廣應用，適用于食源性致病菌的初篩選，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題尋找一種能夠快速、準確、特異性和靈敏性高的大腸桿 菌026、045、0121血清型的引物組，實現對026、045、0121血清型的高通量檢測，并組裝成試 劑盒，便于推廣應用。 為解決上述技術問題，本專利技術提供一種用于檢測大腸桿菌026、045、0121血清型的 引物組，包括以下引物，其核苷酸序列分別為:026-F: 5 '-ITCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3 '， 026-R:5 '-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3 '；045-F:5 '-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '，045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '；012 卜F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '， 0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '； 其特異性擴增的目的片段大小分別為:若電泳結果出現159bp條帶為大腸桿菌026 血清型；出現241bp條帶為大腸桿菌045血清型；出現632bp條帶為大腸桿菌0121血清型。 所述引物組在制備檢測大腸桿菌026、045、0121血清型試劑盒中的應用。 4.在一些實施例中，所述大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒還含有商品化 的2XPCR反應液試劑。另一方面，本專利技術還提供所述試劑盒在用于檢測大腸桿菌026、045、0121血清型的 檢測方法，大腸桿菌菌液或其DNA提取物作為模板，用所述的0抗原特異性引物進行PCR擴 增，對擴增產物進行檢測，電泳結果出現159bp條帶為大腸桿菌026血清型；出現241bp條帶 為大腸桿菌045血清型；出現632bp條帶為大腸桿菌0121血清型。 所述PCR反應體系為50yL時含有：2XPCRBuffer 25此、終濃度為10uM引物混合液5 此、模板1 yL、超純水19uL。 PCR反應參數：95°C預變性 15min;95°C30s，55°Clmin 30s，72°Clmin 30s，30個循 環；72°C10min。本專利技術所述試劑盒在用于檢測大腸桿菌026、045、0121血清型的方法，包括下列步 驟： 1)大腸桿菌模板的制備 將待測大腸桿菌菌株菌液接種至商品化的VIB液體培養基，37°C過夜搖菌，取lmL 菌液，分別用煮沸法和商品化細菌基因組提取試劑盒，進行模板制備； 2)特異性引物的制備所述的0抗原特異性引物026-F、026-R、045-F、045-R、0121-F 和0121-R的使用濃度為10uM;引物稀釋液置于-20°C保存備用，避免反復凍融； 3)PCR反應體系的建立和擴增 取PCR管，分別加2XPCR反應混合液25yL、引物026-F、026-R、045-F、045-R、0121-F 和0121-R混合液5yL、模板1. OyL、超純水19. OyL，混勻;PCR反應參數:95 °C預變性15min; 95 °C 30s，55 °C lmin30s，72 °C lmin30s，30 個循環；72 °C lOmin; 4)PCR檢測結果判定 取lOyLPCR產物，點樣于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳板孔中，120V電壓，電泳20min，于凝 膠成像系統下拍照判定，判定前提條件為陰性對照無任何條帶出現，具體判定方法：電泳結 果出現159bp條帶為大腸桿菌026血清型；出現241bp條帶為大腸本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測大腸桿菌O26、O45、O121血清型的引物組，其特征在于，包括以下引物，其核苷酸序列分別為：O26?F:5'?TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA?3',O26?R:5'?TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG?3'；O45?F:5'?CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC?3',O45?R:5'?TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC?3'；O121?F:5'?ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC?3',O121?R:5'?ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA?3'；任選的，含有或者不含有其它引物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王金良，沈志強，陳金龍，
申請(專利權)人：山東省濱州畜牧獸醫研究院，
類型：發明
國別省市：山東;37